Electrochemical detection of miR21 in breast cancer cell lysates using conducting polymer polypyrrole, redox indicator meldola`s blue and pencil graphite electrode

Abstract

Bu çalışmada hücre hatların gibi gerçek örneklerde miR21' in tespiti için bir elektrokimyasal nükleik acid biyosensorü tasarlanmıştır.Biyosensörün üretiminin doğru hedefi, immobilizasyon ve tespit yöntemini seçmek üzere üç basamağı bulunmaktadır. Meme kanseride up regüle olan miR21 için hedef olarak antimiR21 seçilmiştir. Katı faz hibritleşme sentetik miR21 ya da MCF-7 hücre hatlarından elde edilen total RNA' daki miR21 seçilmiştir. MCF-7 fazlaca miktarda up regüle olmuş miR21 içermektedir. Ayrıca antimiR21' in sadece miR21'e özgü olduğunu ispatlamak için HUH-7 hücre hattı kullnılmıştır. HUH-7 zengin miktarda miR122 içermektedir.Polipirolün (PPy) PGE yüzeyine karakterizasyonu elektrokimyasal impedans spektroskopisi (EIS) ve differensiyal puls voltametrisi (DPV) ile kanıtlanmıştır. Hibrit sinyali DPV ve yük transfer direnci (Rct) ile ölçülmüştür. Rct değerleri elektrokimyasal daire fit ile belirlenmiştir. İletken polimer,PPy sadece çok düşük bir tayin sınırı sağlamakla kalmamış ayrıca antimiR21' in daha etkili bir biçimde imobilizasyonu sağlamıştır. PPy çözeltisi asetat tampon çözeltisi (pH:4.80) kullanarak hazırlanmıştır. PPy, pyrrole çözeltisinden tekrarlı döngüsel voltametri kullanarak elde edilmiştirİlk basamak olarak döngü sayısı belirlenmiştir. İkinci basamakta pH, imobilizasyon yöntemi, prob derişimi, hibritleşme zamanı, hedef derişimi gibi parametreler optimize edilmiştir. Döngü sayısı 5, pirol çözeltisinin pH 4.80, prob derişimi 5 µg/ml, hedef derişimi 7 µg/ml, hibritleşme süresi 30 dakika, imobilizasyon yöntemi antimiR21' in hapsolması olarak bulunmuştur. miR21' in elektrokimyasal çalışmaları DPV kullanarak redoks indikatörü Meldola mavisi, EIS kullanarak redoks probu potasyum ferri siyanür (K3[Fe(CN)6])ile gerçekleştirilmiştir. PPy kaplı PGE ve çıplak PGE' nin Rct değerleri karşılaştırılmıştır ve PPy kaplı PGE 4 kat daha az Rct değerine sahip olduğu gözlemlenmiştir. miR21' in elektrokimyasal tespiti koplimenter olmayan hedef, tam olarak eşleşen hedef ve uyumsuz hedef ile gerçekleştirilmiştir. Açıkça gözükmektedir ki antimiR21, miR21' e özgüdür ve uyumsuz dizilerde bile miR21'e ait bir cevap elde edilmektedir. Ayrıca herbir elektrot oldukça iyi tutarlılık sergilemiştir.The proposed biosensor with the detectionof 1.4 pmol is applicable for analysis of certain microRNAs as well as miR21 from total RNAs isolated from cell lysates.Önerilen biyosensör 1.4 pmol tayin sınırına sahiptir ve bu değer sentetik ve total RNA' lardan elde edilen mikroRNA'lar için olduça uygundur.

In the present work, an electrochemical nucleic acid biosensor has been designed for the purpose of detection of miR21 in real samples, i.e cell lysates. The fabrication of biosensor has three steps choosing the right target, immobilization method and detection methods. The probe of the upregulated miR21 in breast cancer was determined antimiR21. Entrapment of antimiR21 onto pencil graphite electrode (PGE) was chosen as the immobilization methods for the study. Solid phase hybridization with either synthetic miR21 or miR21 included in total RNA isolated from MCF-7 cell line. MCF-7 contains large amount of upregulated miR21 also in order to assert the antimiR21 is specific to the miR21 HUH-7 cell lines were used. HUH-7 cell line comprises of rich amount of miR122. The characterization of Polypyrrole (PPy) modification onto the PGE surface has been proved via, Electrochemical impedance spectroscopy (EIS) and differential pulse voltammetry (DPV). Hybrid signal measured via DPV and the charge transfer resistance, Rct values recorded via electrochemical circle fit option of EIS have been used. Conducting polymer, PPy enabled not only very low detection limit but also more effective immobilization of antimiR21. PPy solution was prepared using acetate buffer solution (pH:4.80). PPy was achieved by using repeated cyclic voltammetry from pyrrole solution. At the first step the cycle number was chosen. At the second step parameters such as the pH, immobilization method, probe concentration, hybridization time, target concentration were optimized. It was observed that cycle repetition number was 5, pH of the pyrrole solution was 4.80 , the probe concentration was 5 µg/ml, the target concentration was 7µg/ml, hybridization time was 30 minutes, immobilization method was found the entrapment of the antimiR21.Electrochemical studies of miR21 was achieved using redox indicator Meldola's Blue via DPV and redox probe potassium Ferri cyanide (K3[Fe(CN)6] )via EIS. The PGE coated with PPy and the bare electrode Rct values were compared and it was found that the PGEs coated with PPy provided 4 times lower Rct values than bare PGEs. Electrochemical detection of miR21 was carried out using a non complementary target, full match target and mismatch target. It was clearly shown that the antimiR21 is specific to the miR21 and even with the mismatch sequences of the miR21 it was possible to gain a response. Also each electrode showed great stability.The proposed biosensor with the detectionof 1.4 pmol is applicable for analysis of certain microRNAs as well as miR21 from total RNAs isolated from cell lysates.