Taq DNA polimeraz enziminin E. coli`de ekspresyonu ve saflaştırılması

Abstract

TAQ DNA POLIMERAZ ENZİMİNİN ECOLİ'DE EKSPRESYONU VE SAFLAŞTIRILMASI ÖZET: Thermits aquaticus (Taq) DNA polimeraz özellikle spesifik DNA dizilerini çoğaltmak amacıyla polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan, sıcaklığa dayanıklı bir enzimdir. Moleküler tekniklerde rutin ve çok miktarda kullanılan, maliyeti yüksek olan bu enzimi laboratuvar şartlarında elde etmenin önemli olacağı kanısındayız. Bu amaçla, rekombinant Taq polimeraz geni E.coli 'de ekspre edilmiş ve laboratuvarda kullanılabilirliği test edilmiştir. Elde edilen enzimin karakterizasyonu yapılarak, ticari formlarıyla karşılaştınlmıştır. Taq DNA polimerazın ekspresyon şartlan farklı metotlar kullanılarak optimize edilmiştir. E.coli 'de ekspre edilen Taq polimeraz enzimi, ısı ile denatürasyon, amonyum sülfat çöktürmesi ve iyon değişim kromatografısi yöntemleri kullanılarak saflaştınlmıştır. Saflaştınlan enzimin konsantrasyon tayini, Bradford metodu uygulanarak yapılmıştır. Saflaştınlan enzimlerin saflık derecesi SDS-PAGE kullanılarak belirlenmiştir. DNaz aktivite testi ile, elde edilen enzimde DNA'nın hidrolizine yol açan DNaz olup olmadığı da değerlendirilmiştir Enzimin aktivite tayini Standart polimeraz zincir reaksiyonu yapılarak, ticari formuyla karşılaştınlarak yapılmıştır. Farklı yöntemlerle saflaştırılan enzimler ve farklı enzim miktarları, farklı MgCİ2 konsantrasyonları ve farklı DNA konsantrasyonlan denenerek, üretilen enzim için en uygun PZR şartları belirlenmiştir. Üretilen enzimin kararlılık koşulları da, farklı derecelerde (+4, -20 ve -70) saklanan enzimin belirli periyotlarda aktivite tayini yapılarak belirlenmiştir. Sonuç olarak elde edilen enzim ile yapılan PZR sonuçlan, bu enzimin standart PZR metotlarında rahatlıkla kullanılacak düzeyde saf olduğu ve maliyetinin de ticari enzime göre de karşılaştırılamayacak kadar düşük olduğu belirlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Taq DNA polimeraz, ekspresyon, PZR, E.coli, rekombinant enzim

EXPRESSION AND PURIFICATION OF TAQ DNA POLYMERASE ENZYME IN E. COLI ABSTRACT Thermus aquaticas DNA polimerase, Taq polymerase, is a heat stable enzyme used for PCR reaction, which is a tecnique for in vitro amplification of the specific regions of DNA. Due to high expense of enzyme, the enzyme, which is widely and routinely used for molecular tecniques, should be locally produced in laboratory. For this purpose, recombinant Taq polimerase gene was expressed in E.coli and validated for laboratory use and the characterisation of the obtained enzyme was performed and compared with the commercial counterpart. The expression conditions of Taq polymerase was optimised using different protocols and taq polymerase was purified with two different methods, namely, amonium sulphate precipitation and ion exhange chromotography. The concentration of the purified enzyme was determined using Bradford method and the purity of the protein extract was evaluted by SDS PAGE analysis. DNAase contamination assay was performed and no DNAase contamination in purified enzyme extract was detected. Enzyme activity of locally produced enzyme was determined using standart PCR reaction and compared with the commercial enzyme. The optimum PCR condition for the produced enzyme was determined with the enzymes purified from different methods, different MgCİ2 and DNA concentration. The stability condition of the enzyme was found using activity assay of enzymes stored in different conditions namely -70 C, - 20C and +4C. Finaly, The PCR results obtained from the produced enzyme demonstrated that the produced enzyme was pure enough for the use of standart PCR reaction and the expense of enzyme was much cheaper and uncomparable than the commercial enzyme. Key words. Taq polymerase enzyme, Expression, E.coli, PCR, recombinant enzyme