Cynara scolymus L. bitkisinden elde edilen polifenol oksidaz enziminin kinetik özelliklerinin araştırılması

Abstract

öz CYNAJRA SCOLYMUS L. BİTKİSİNDEN ELDE EDİLEN POLİFENOLOKSİDAZ ENZİMİNİN KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN ARAŞTIRILMASI Hatibe ERTÜRK Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı (Yüksek Lisans Tezi / Tez danışmanları: Yrd.Doç.Dr. Yusuf TURAN - Yrd.Doç.Dr.Serap DOĞAN) Balıkesir, 2004 Bu çalışmada, enginardan (Cynara scolymus L.) polifenoloksidaz (PFO) enzimi amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemleri ile kısmen saflaştırılmıştır. Enginar ekstraktlanmn toplam fenolik madde içeriği Folin-Ciocalteau prosedürüne göre spektrofotometrik olarak belirlenmiştir. Protein içeriği de Bradford metodu kullanılarak tayin edilmiştir. Enginardan kısmen saflaştırılmış olan polifenoloksidazın substrat spesifikliği, optimum pH, optimum sıcaklık ve ısı inaktivasyonu incelenmiştir. Cynara scolymus L.'den elde edilen polifenoloksidazın 4-metilkatekol, piragallol, katekol ve L- dopa'ya karşı aktivite gösterdiği, L-tirozin, resorsinol ve p-kresoPe karşı aktivite göstermediği tespit edilmiştir. Vmax/Km parameteresi göz önüne alındığında en iyi substratlann sırasıyla 4-metilkatekol, piragallol, katekol ve L-dopa olduğu bulunmuştur. 4-metilkatekol, piragallol ve katekol substratları kullanıldığında enginardan elde edilen PFO için optimum pH'ların sırasıyla 5.0, 8.0 ve 7.0 olduğu tespit edilmiştir. Optimum sıcaklıkların, substrat olarak 4-metilkatekol kullanıldığında 10< °C, piragallol kullanıldığında 20 ° C ve katekol kullanıldığında ise 40 °C olduğu bulunmuştur. PFO aktivitesinin termal inaktivasyonunu belirlemekamacı ile 4-metilkatekol ve piragallol substratlan kullanıldığında benzer profiller elde edilmiştir. 4-metilkatekol ve piragallol substratlan için enzim aktivitesimn artan sıcaklık ve inaktivasyon süresi ile azaldığı tespit edilmiştir. Katekol substratı İçin ise artan inaktivasyon süresi ile başlangıçta enzim aktivitesimn arttığı ve daha sonra artan inaktivasyon süresi ile azaldığı bulunmuştur. L-sistein, EDTA, askorbik asit, gallik asit, 1,4-ditiyoeritrol, tropolon, glutatyon, sodyum azid, benzoik asit, salisilik asit ve 4-aminobenzoik asit enginardan kısmen saflaştırılmış PFO'm inhibisyonu için inhibitörler olarak kullamlmıştır. Elde edilen deneysel sonuçlar EDTA, 4-aminobenzoik, salisilik asit, gallik asit ve benzoik asitin enginar PFO'nı inhibe etmediğini göstermiştir. Ayrıca yukarıda belirtilen substratlar kullanılarak her bir inhibitor için inhibisyon mekanizması belirlenmiştir. Deneysel sonuçlar enginar PPO' sunun inhibisyonu için en etkin inhibitörün tropolon olduğunu göstermektedir. Gözlenmiş inhibisyon tipinin kullanılan substrata ve enzimin kaynağına bağlı olarak değişebileceği tespit edilmiştir. ANAHTAR SÖZCÜKLER: Enginar; Cynara scolymus L., polifenoloksidaz; substrat spesifıkliği; optimum pH ve sıcaklık; ısı inaktivasyonu; inhibisyon. u

ABSTRACT THE INVESTIGATION OF KINETICS PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE OBTAINED FROM ARTICHOKE (CYNARA SCOLYMUS L.) Hatibe ERTÜRK Balıkesir University, Institute of Science, Department of Biology (MSc Thesis / Supervisor: Ass.Prof.Dr. Yusuf TURAN - Ass.Prof.Dr. Serap DO?AN) Balıkesir, 2004 In this study, the polyphenol oxidase (PPO) of artichoke (Cynara scolymus L.) was partially purified by a combination of (NH4)2S04 precipitation and dialysis Secondly, the contents of total phenolic and protein of artichoke head extracts were determined. The total phenolic content of artichoke head was determined spectrophotometrically according to the Folin-Ciocalteau procedure. In addition to protein content was determined according to Bradford method. It was investigated the effects of substrate specificity, pH, temperature and heat-inactivation on polyphenol oxidase activity purified from artichoke. The enzyme showed activity to 4-methylcatechol, pyrogallol, catechol and L-dopa. No activity was detected toward L-tyrosine, resorsinol and p-cresol. According to Vmax/Km values, 4-methylcatechol was the best substrate, followed by pyrogallol, catechol and L-dopa, respectively. The optimum pHs for PPO were 5.0, 8.0 and 7.0 using 4-methylcatechol, pyrogallol and catechol as substrates, respectively. The enzyme activity decreased due to heat-denaturation of the enzyme with increasing temperature and inactivation time for 4-methylcatechol and pyrogallol substrates. inBut, all inactivation experiments for catechol showed that activity of artichoke PPO increased with mild heating, reached a maximum and then decreased with time. Inhibition of artichoke PPO was investigated with inhibitors such as L- cysteine, EDTA, ascorbic acid, gallic acid, D,L-dithiothreitol, tropolone, glutathione, sodium azide, benzoic acid, salicylic acid and 4-aminobenzoic acid using 4- methylcatechol, pyrogallol and catechol as substrates. The presence of EDTA, 4- aminobenzoic acid, salicylic acid, gallic acid and benzoic acid did not cause the inhibition of artichoke PPO. In addition to, it was determined mechanism of inhibition for each inhibitor using sellected substrates. From the results it can be said that the most effective inhibitor for artichoke PPO was troplone. Furthermore, it was found that the type of inhibition depended on the origin of the PPO studied and also on the substrates. KEY WORDS: Artichoke; Cynara scolymus L.; polyphenoloxidase; substrate specificity; optimum pH and temperature; inactivation; inhibition. IV