Ocimum basilicum L.`den elde edilen polifenol oksidaz enziminin saflaştırılması, kinetik ve elektroforetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

oz OCIMUM BASILICUM L.'DEN ELDE EDİLEN POLİFENOL OKSİDAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRILMASI, KİNETİK VE ELEKTROFORETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Pınar TURAN Balıkesir Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı (Yüksek Lisans Tezi/ Tez Danışmanları: Doç.Dr. Mehmet DOĞAN- Yrd.Doc.Dr. Serap DOĞAN) Balıkesir, 2005 Bu çalışmada Ocimum basilicum L.'den ekstrakte edilen polifenol oksidazm (PFO) kısmi karakterizasyonu tanımlanmaktadır. Polifenol oksidaz, Ocimum basilicum L.'den ekstrakte edilerek amonyum sülfat çöktürmesi, diyaliz ve Sepharose 4B-L-tirozin-p-aminobenzoik asit afinite kolonuyla saflaştırılmıştır. Amonyum sülfat çöktürmesi ve diyaliz işlemlerinden sonra elde edilen örnekler polifenol oksidazın karakterizasyonu için kullanılmıştır. Afinite kromotografisi ile 11,5 katlık saflaştınlma sağlanmıştır. Elde edilen saf enzim, sodyumdodesilsülfat- poliakrilamidjel (SDS-PAGE) elektroforezinde tek bir bant olarak gözlenmiştir. Polifenol oksidazın molekül ağırlığı yaklaşık 54 kDa olarak belirlenmiştir. Ayrıca Ocimum basilicum L.'nin protein içeriği ve toplam fenolik madde içeriği tayin edilmiştir. Ocimum basilicum L.'nin toplam fenolik madde içeriği Folin-Ciocalteu metodu kullanılarak belirlenmiş ve 100 g taze bitki için 280 mg fenolik madde içeriği bulunmuştur. Protein içeriği Bradford metoduna göre tayin edilmiştir. Polifenol oksidaz 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substratlarına karşı aktivite gösterirken, tirozin substratına karşı aktivite göstermemiştir. Enzimin katalizleme gücünü gösteren Vmax/Km değerlerine göre en iyi substratın 4-metilkatekol olduğu ve bunu sırasıyla pirogallol ve katekolün izlediği bulunmuştur. 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substratları için sırasıyla optimum pH değerleri 6,0; 8,0 ve 9,0 olarakbulunmuştur. Optimum sıcaklık değerleri 4-metilkatekol için 20, katekol için 40 ve pirogallol substratı için ise 50 °C olarak tespit edilmiştir. Optimum sıcaklık ve pH değerlerinin çalışılan substratlara bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substratları için enzim aktivitesinin, artan sıcaklık ve inaktivasyon süresi ile, ısı denaturasyonundan dolayı azaldığı bulunmuştur. ANAHTAR KELİMELER: Ocimum basilicum L.; polifenol oksidaz; saflaştırma; substrat spesifikliği; pH; sıcaklık; ısı inaktivasyonu; inhibisyon. ıı

ABSTRACT PURIFICATION AND INVESTIGATION OF KINETIC AND ELECTROPHORETIC PROPERTIES OF POLYPHENOL OXIDASE ENZYME OBTAINED FROM OCIMUM BASILICUM U Pınar TURAN Balıkesir University, Institute of Science, Department of Chemistry (MSc Thesis / Supervisors: Associate Prof.Dr. Mehmet DO?AN- Assistant Prof.Dr. Serap DO?AN) Balıkesir, 2005 In this study, a partial characterization of polyphenol oxidase (PPO) extracted from Ocimum basilicum L. has been described. Polyphenol oxidase from Ocimum basilicum L. was extracted and then purified through (NH4)2S04 precipitation, dialysis and a Sepharose 4B-L-tyrosine- p-aminobenzoic acid affinity column. The samples obtained from (NH4)2S04 precipitation and dialyses were used for the characterization of PPO. At the end of purification by affinity chromatography, 1 1.5- fold purification was achieved. The purified enzyme exhibited a clear single band on sodiumdodecylsulfate-polyacrylamidegel electrophoresis (SDS-PAGE). The molecular mass of the enzyme was estimated to be about 54 kDa. The contents of total phenolic and protein of Ocimum basilicum L. extracts were determined. The total phenolic content of Ocimum basilicum L. was determined spectrophotometrically according to the Folin-Ciocalteu procedure and was found to be 280 mg/100 g on a fresh weight basis. Protein content was determined according to Bradford method. The enzyme showed activity to 4-methylcatechol, catechol and- pyrogallol substrates, but not to tyrosine. 4-methylcatecol was the best substrate due to the highest Vmax/Kra value, followed by pyrogallol and catechol. The optimum pH was at 6.0; 8.0 and 9.0 for 4-methylcatechol, catechol and pyrogallol substrates, respectively. The enzyme had an optimum temperature of 20, 40 and 50 °C for 4- 111methylcatechol, catechol and pyrogallol substrates, respectively. It was found that optimum temperature and pH were dependent on the substrates studied. The enzyme activity decreased due to heat denaturation of the enzyme with increasing temperature and inactivation time for 4-methylcatechol, catechol and pyrogallol substrates. Key Words: Polyphenol oxidase; Ocimum basilicum L.; purification; substrate specificity; pH; temperature; heat inactivation; inhibition. IV