Yerel izolat Bacillus sp. GYTE-L 15 lipazının üretilmesi, saflaştırılması ve nitelendirilmesi

Abstract

IV ÖZET Lipazlar, (triaçilgliserol açilhidrolazlar E.C.3. 1.1.3) gliserol ve uzun zincirli yağ asitlerinden şekillenen esterlerin, sentez ve hidrolizini kataliz eden enzimler olup, günümüzün büyüyen enzim pazarında çok önemli bir yer tutmaktadırlar. Lipazlar; gıda, deterjan, kağıt, kozmetik ve kimya sanayinde kullanılan enzimlerdir. Memeli ve yüksek bitkiler tarafından da üretilmelerine karşın, endüstriyel uygulamalarda daha çok bakteri, mantar ve maya gibi mikroorganizmaların lipazları tercih, edilmektedir. Bacillus soyları en önemli endüstriyel enzim kaynakları arasında yer alırlar. Bu tez çalışmasında, yerel izolat Bacillus sp. GYTE-L15 soyu tarafından salgılanan lipazın üretilmesi, saflaştırılması ve nitelendirilmesi hedeflenmiştir. Daha önce klasik yöntemler ile tanımlanan L15 soyunun, moleküler tiplendirme yöntemlerinden birisi olan 16S rDNA dizi analizi çalışmaları ile tanımlanması, bu tez çalışmasının bir diğer hedefidir. GYTE Enzim Moleküler Genetiği Grubu tarafından zeytin karasuyundan izole edilen Bacillus sp. GYTE-L15 soyunun besi yerine salgıladığı lipaz, bu çalışma kapsamında kültür üst sıvısı proteinlerinin % 80 amonyum sülfat ile çöktürülmesini izleyen Sefakril S-200 HR moleküler elek kolon kromatografi sinin kullanıldığı bir yöntemle saflaştırılmıştır. % 18.78 verimle 6 kez saflaştırılan enzimin spesifik aktivitesi 8132 U/mg bulunmuştur. Yapılan SDS-PAGE analizi sonuçlarına göre, Bacillus sp. GYTE-L15 soyu lipazının moleküler ağırlığı -10-11 kDa olarak tahmin edilmiştir. Bu özelliği ile GYTE-L15 lipazı, bilinen en küçük iki lipazdan birisidir. Yapılan enzim nitelendirme çalışmalarında, optimal reaksiyon sıcaklığı 40 °C olarak belirlenmiş, 45 ve 50 °C'ta enzimin başlangıçtaki aktivitesinin sırasıyla % 83 ve % 40' m koruduğu saptanmıştır. Optimal reaksiyon pH'sı 9.0 olan L15 lipazının, pH: 8.5-10.0 aralığındaki kararlılığı % 100-66 arasında bulunmuştur. 1 ve 10 mM derişimdeki çeşitli metal iyonlarının, L15 lipazı üzerinde kısmen inhibitor etki gösterdiği, inhibisyonun daha çok FeCİ3, FeS04 ve AlCl3'ün 10 mM'lık derişimlerinde güçlendiği beklenmiştir.SDS, Tween 80 ve CTAB varlığında azalan enzim aktivitesi, Triton X-100 ve sodyum deoksikolat varlığında yükselmiştir. Gliserol, EG ve DMSO, enzimin sıcaklık kararlılığını önemli derece arttırmıştır. Ş-ME ve DTT enzim aktivitesini kısmen yükseltmiştir. EDTA'nın aktivite üzerindeki etkisi sınırlı bulunduğundan, L15 lipazanın bir metalloenzim olmadığı ve aktivitesi PMSF ile büyük oranda inhibe olduğundan, enzimin aktif bölgesinde bir serin rezidüsü taşıdığı sonucuna varılmıştır. Enzim aktivitesi, metanol ve izoprbpanoi varlığında yükselirken, etanol, aseton, asetonitril ve izoamil alkol varlığında azalmıştır. Bacillus sp. GYTE-L15 lipazının sahip olduğu özellikler, enzimin çeşitli biyokataliz süreçlerinde ve deterjan formülasyonlarında denenebileceğine işaret etmiştir. 16S rDNA dizi analizinden elde edilen veriler B. pumilus soylarından daha önce elde edilen dizilimlere (NCBI GeneBank Veritabanı) % 98 oranında benzerlik gösterdiğinden, Bacillus sp. GYTE-L15'in bir B. pumilis soyu olabileceği sonucuna varılmıştır.

SUMMARY Lipases (triacylglyceroi acylhydrolases, EC 3.1.1.3) which catalyze the hydrolysis and the synthesis of esters formed from glycerol and long-chain fatty acids, have an important position in current devoloping enzyme market Lipases are used primarily in food, detergent, paper, cosmetics and chemical industries. Although upases are produced by mammals and higher plants, the ones used in industrial applications are preferably from microbial origin such as bacteria, fungi and yeast Bacillus species are considered among the most important industrial enzyme sources. The production, purification and characterization of the lipase from the local isolate Bacillus sp. GYTE-L15 have been aimed in this thesis work. Determination of the 16S rDNA sequence of the GYTE-L15 strain which was already characterized by the morphological and biochemical methods was another goal of the current study. The lipase secreted into the growth medium by Bacillus GYTE-L15 which was isolated from the olive vegetation-water by the GYTE Enzyme Molecular Genetics Group, was purified by Sephacryl S200 HR gel filtration chromatography following 80 % amonium sulphate precipitation. The specific activity of six fold purified enzyme, with recovery yield of 18.78 %, was found to be 8132 U/mg. According to the SDS-PAGE profile, the molecular weight of Bacillus sp. GYTE- L15 lipase was estimated to be ~ 10-11 kDa. This lipase is one of two smallest Upases known till now. Optimal reaction temperature was 40 °C. The remaining activity of the enzyme was 83 % and 40 % of the initial activity at 45 °C and 50 °C, respectively. The optimal pH was 9.0 and enzyme was stable between 100 % and 66 % in the range of pH 8.5-10.0, respectively. 1 and 10 mM concentrations of various metal ions show partial inhibitory effect on the LI 5 lipase activity, which was strongly inhibited especially in the presence of 10 mM FeCb, FeSC«4 and A1C13.While the enzyme activity was decreased in the presence of SDS, Tween 80 and CTAB, it was increased in. the presence of Triton X-100 and sodium deoxycholate. The temperature stability of the enzyme increased significantly in the presence of glycerol, ethylene glycol and dimethylsulfoxide. Enzyme activity partially increased with ŞME and DTT. It is suggested that the L15 lipase is not a metalloenzyme since EDTA has a limited effect on the enzyme activity. Strongly decreased enzyme activity in the presence of PMSF indicated that a serine residue takes place at the catalytic triad of the active site. While enzyme activity was increased with methanol and isopropanol, it was reduced in the presence of ethanol, acetone, acetonitrile and isoamyl alcohol. The determined features of Bacillus sp. GYTE-L15 lipase were indicated that this enzyme could be tested as a biocatalyst in various processes and detergent formulations. Since the sequence obtained from 16S rDNA analysis shows 98 % similarity with the 16S rRNA genes of various B. pumilus strains at NCBI GeneBank Database, it was concluded that the Bacillus sp. GYTE-L15 could be a strain of B. pumilus.