Maramara denizi ve Karadeniz`den izole edilen bakterilerin saflaştırılması ve tanımlanması

Abstract

Bu doktora tez çalışması kapsamında örnekleme bölgeleri olarak, şehir ve ev deşarjı almayan İstanbul Boğazı'nın Marmara çıkışı (M) ile Karadeniz'in özelliklerini tam olarak temsil eden ve İstanbul Boğazı'nın Karadeniz çıkışından (K) birer ve İzmit Körfezi' nde (İK) iç, orta ve dış körfezi temsil eden üç farklı istasyon toplamda beş istasyon belirlenmiştir. Deniz suyu örnekleri, Marmara Denizi ve Karadeniz istasyonlarından birer defa, İzmit Körfezi istasyonlarından ise mevsimsel farklılıklar gözetilerek farklı zamanlarda dört defa alınmıştırMarmara Denizi, Karadeniz ve İzmit Körfezi' ni temsil eden istasyonlardan alınan deniz suyu örneklerinden sırası ile 132 adet (M), 90 adet (K), 82 adet (İK 1), 119 adet (İK 2), 129 adet (İK 3), 146 adet (İK 4) olmak üzere toplam 698 adet izolat elde edilmiştir. Bu izolatların kolonilerine ait özellikler (koloni görünümü, rengi, kenarı, yüksekliği, yüzeyi vb.), Gram boyama ve katalaz testleri yapılmıştır. Toplam 698 adet bakteri izolatının içinden, farklı koloni morfolojisi gösteren örneklerden 46 adet izolat seçilmiştir. Bu izolatların saf olarak elde edilme basamağında izolat sayısı 53 adete ulaşmıştır. Çizgi ekimlerle saf olarak elde edilen bu izolatlar temel mikrobiyolojik tanımlama testleri yapılmıştır.Seçilmiş izolatlar, VITEK 2 Kompakt otomatik tanımlama sistemi ile Sphingomonas paucimobilis, Acinetobacter baumannii, Acinetobacter haemolyticus, Bacillus cereus / Bacillus thuringiensis, Brucella melitensis, Brevundimonas diminuta / vesicularis, Brevibacillus laterosporus olarak birbirinden farklı 7 saf tür şeklinde tanımlanmış, 11 izolat tanımlanamamıştır.İzolatların çoklu ağır metal dirençliliği, minimum inhibisyon konsantrasyonu (MIC) değerleri belirlenerek tespit edilmiştir. Elde edilen sonuçlar ile çoklu ağır metal ve antibiyotik dirençliliği, izolatların ekstraselüler enzim üretim yetenekleri arasındaki ilişki incelenmiştir. Mevcut çalışmanın sonuçları, seçilmiş izolatların çoğunun Cu+2, Cd+2 ve Cr+3' a özel dirençlilikleri ile metal dirençliliği indikatörleri olarak tanımlanabilecek Acinetobacter ve Bacillus cinslerine ait olduğunu göstermiştir. Ağır Metal dirençli izolatların çoğunun aynı zamanda en az 2 antibiyotiğe dayanıklı olduğu ve ağır metal-antibiyotik arasındaki çifte dirençlilik, Cd+2 ve Cu+2 metalleri ve kloramfenikol ve ampisilin antibiyotikleri arasında %100 olarak tespit edilmiştir.Seçilmiş 53 izolat 16S rDNA dizi analizi yöntemi ve BLASTN programı kullanılarak NCBI veri bankasında kayıtlı türlerin 16S rDNA dizileri ile karşılaştırılmıştır. Bu sonuçlara göre seçilmiş izolatlar içinde Acinetobacter sp. ve Bacillus sp. oldukça baskın cinsler olarak ortaya çıkmıştır. BLASTN sonucu Vitek 2 Kompakt otomatik tanımlama sitemi sonuçları ile genus seviyesinde identik, tür seviyesinde ise benzer bulunmuştur.Anahtar Kelimeler: Marmara Denizi, İzmit Körfezi, İzolasyon, İdentifikasyon, Vitek otomatik tanımlama sistemi, 16S rDNA

In the frame work of the Ph D thesis, sample collection sites were determined as Marmara Sea entrance (M) where there was no urban or house discharge, and Black Sea entrance (B), from Bosphorus which represents the full characteristics of Black Sea, and internal, middle and external regions of Izmit Bay (IB). Sea of Marmara and Black Sea samples were collected once while, Izmit Bay samples were collected four times, at different periods depending on seasonal changes.A total of 698 culturable marine bacteria isolates have been obtained from these collection sites: 132 isolates (M), 90 isolates (B), 82 isolates (IB 1), 119 isolates (IB 2), 129 isolates (IB 3), 146 isolates (IB 4).The isolates of all purified 698 marine bacteria were initially characterized phenotypically by means of a combination of phenotypic tests including colonial apperance, cell morphology, Gram and spore staining, oxidase and catalase production. Following initial characterization, 46 out of 698 original isolates were preselected for further investigations especially to their ability to produce liquit deposition. 46 out of 698 marine isolates were purified by streaking plate methods. In this stage totally 53 isolates were purified. For these isolates conventional microbiological tests were performed. According to basic microbiological test results, manual identification stage has been carried out with using Bergey?s Manual of Systematic Bacteriology reference book.Selected isolates also identified at the species-level by using VITEK 2 Compact Automatic Identification System. According to the results, the samples have been determined as Acinetobacter baumannii, Bacillus cereus / Bacillus thuringiensis, Acinetobacter haemolyticus, Spingomonas paucimobilis, Brucella melitensis, Brevundimonas diminuta / vesicularis and Brevibacillus laterosporus. Other 11 bacteria species were not identified.Muliple heavy metal tolerance of the isolates were determined according to minimal inhibition concentration (MIC) values. Moreover, presence of possible interaction between multiple heavy metal and antibiotic resistance and extracellular enzyme production ability of the isolates were also examined result of this study revealed that majority of the Cu+2, Cd+2, Cr+3 resistant selected isolates were belonging to Acinetobacter sp. and Bacillus sp. genera which could be identified as indicators of heavy metal tolerance. In addition, majority of the metal resistant isolates were found to be resistant to at least 2 antibiotics and double resistance between heavy metal (Cd+2 and Cu+2) and antibiotic (chloramphenicol and ampicillin) resistance was determined as 100%.Molecular characterization of the selected 53 isolates was also carried out by using 16S rDNA analysis and the obtained sequences compared with the sequence of the species sequence of the exist in the database of NCBI by using BLASTN program. According to the results Acinetobacter sp. and Bacillus sp. were appeared to be highly dominant genera among the selected isolates. In the genus level BLASTN results were found to be identical with the Vitek 2 Compact Automatic Identification System results while they were similar in the species level.Key Words: Sea of Marmara, Izmit Bay, isolation, identification, VITEK Automatic Identification System, 16S rDNA