Lactuca sativa L.`den elde edilen polifenoloksidazın kısmi karakterizasyonu

Abstract

Bu çalısmada, marul (Lactuca sativa L.) polifenol oksidaz (PFO) enzimininkısmi saflastırılması yapılmıs ve bazı kinetik özellikleri incelenmistir. Lactucasativa L.'den ekstrakte edilen polifenol oksidaz (NH4)2SO4 (amonyum sülfat)çöktürmesi ve diyaliz islemleri sonucunda kısmi olarak saflastırılmıstır.Lactuca sativa L.'nin toplam fenolik madde miktarı Folin-Ciocalteau metodukullanılarak belirlenmistir. Bu metoda dayanarak Lactuca sativa L.'de 100 g tazebitki için 304 mg fenolik madde içerigi tespit edilmistir. Protein içerigi ise Bradfordyöntemi kullanılarak tespit edilmistir ve 100 g taze bitki için 494/mg mL olarakbulunmustur.Ayrıca PFO'ın substrat spesifikligi, optimum pH ve sıcaklık degerleri ve ısıinaktivasyonu incelenmistir. PFO aktivitesi L-tirozin, 4-metilkatekol, katekol vepirogallol substartları kullanılarak incelenmistir. Polifenol oksidaz aktivitesi 4-metilkatekol ve katekol için 420 nm'de, pirogallol için 320 nm'de ve L-tirozin 484nm'de spektrofotometrik olarak ölçülmüstür. Diger taraftan, Lactuca sativa L.'denelde edilen PFO, L-tirozine karsı aktivite göstermemistir. Kinetik parametreler olanKM ve Vmax degerleri Lineweaver-Burk grafiginden hesaplanmıstır. Enziminkatalizleme gücünü gösteren Vmax/ KM parametresine göre en iyi substrat pirogallolonu takiben katekol ve 4-metilkatekolün oldugu tespit edilmistir. Lactuca sativa L.polifenoloksidazının optimum sıcaklık aktivite degerleri katekol için 40 0C, 4-metilkatekol ve pirogallol için 30 0C'de oldugu bulunmustur. Marul PFO'ınınoptimum pH degerleri ise 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol için sırasıyla 6.5, 8.0ve 7.5 olarak saptanmıstır. Lactuca sativa L. PFO'nın 35 0C, 55 0C ve 75 0C'de ısıinaktivasyon çalısmaları 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol substratlarıkullanılarak yapılmıstır. Özellikle 4-metilkatekol ve katekol substratlarıkullanıldıgında artan inaktivasyon süresine paralel olarak PFO aktivitesinin belirginsekilde azaldıgı gözlenmistir.Degisik inhibitörlerin maruldan kısmen saflastırılan PFO aktivitesi üzerineetkisi, 4-metilkatekol, katekol ve pirogallol fenolik substratları kullanılarakspektrofotometrik olarak incelenmistir. Bu amaçla, tropolon, glutatyon, askorbikasit, 4-aminobenzoik asit, sodyum azid ve benzoik asit inhibitörleri degisikkonsantrasyonlarda kullanılarak Lactuca sativa L. PFO aktivitesi inhibe edilmeyeçalısılmıstır. Fakat, sodyum azid ve benzoik asitle Lactuca sativa L.'den elde edilenPFO inhibe edilememistir. Diger taraftan daha önce belirtilen substratlar kullanılarakher bir inhibitör için inhibisyon mekanizması belirlenmistir. Deneysel sonuçlaragöre marul PFO'nun inhibisyonu için en güçlü inhibitörün glutatyon oldugunugöstermistir.ANAHTAR SÖZCÜKLER : Marul; Lactuca sativa L.; Polifenol oksidaz;substrat spesifikligi; pH; sıcaklık; ısı inaktivasyonu; inhibisyon.

In this study, polyphenol oxidase of lettuce ( Lactuca sativa L.) was partiallypurified and we investigated its some kinetic parametres. Polyphenol oxidase oflettuce (Lactuca sativa L.) was extracted and partially purified through ammoniumsulphate ( (NH4)2SO4 ) and dialysis.The total phenolic content of Lactuca sativa L. was determined according tothe Folin-Ciocalteu method. Total phenolic content was found to be 304 mg/ 100 gon a fresh weight basis. Protein content was determined according to Bradfordmethod and it was found to be 494 mg mL- for ever 100 g on a fresh weight .In addition it was investigated the effects of substrate specificity, pH,temperature and heat-inactivation on polyphenol oxidase. PPO activity wasdetermined using 4-methylcatechol, catechol, pyrogallol and L-tyrosine as substrates.Polyphenol oxidase activity was measured spectrophotometrically for 4-methylcathechol and catechol at 420 mn, for pyrogallol at 320 nm and for Ltyrosineat 484 mn. On the other hand, lettuce (Lactuca sativa L.) showed noactivity toward the L-tyrosine. Kinetic parametres, KM and Vmax , were calculatedfrom Lineweaver-Burk graph. According to Vmax/ KM parametres pyrogallol was thebest substrat, followed by catechol and 4-metyl catechol. The optimum temperaturevalues of Lactuca sativa L. polyphenol oxidase for catechol found to be 40 0C, for 4-methyl catechol and pyrogallol found to be 30 0C. The optimum pH values oflettuce PPO were 6.5, 8.0 and 7.5 for 4-methyl catechol, catechol and pyrogallol,respectively. Polyphenol oxidase of Lactuca sativa L.was investigated heatinactivationat 35 0C , 5 5 0C and 75 0C using 4-methylcatechol, catechol andpyrogallol as substrates. Especially, the enzyme activity decreased due to heatdenaturationof the enzyme with increasing temperature and inactivation time forcatechol and 4-methylcatechol substrates.The effect of different inhibitors on partially purified lettuce polyphenoloxidase activity was investigated by spectrophotometrically, using 4-methylcatechol, catechol and pyrogallol as phenolic substrates. For this purpose, tropolone,glutathione, ascorbic acid, 4-aminobenzoik acid, sodium azide and benzoic acid wereused to inhibit the activity of Lactuca sativa L. PPO at different concentrations.However, the presence of sodium azide and benzoic acid didin?t have inhibitor effecton the activity of Lactuca sativa L. polyphenol oxidase. On the other hand, it wasdetermined mechanism of inhibition for each inhibitor using sellected substrates.According the experimental results it can be said that glutathione was found to be themost potent inhibitor for Lactuca sativa L. polyphenol oxidase.KEY WORDS : Lettuce; Lactuca sativa L.; polyphenoloxidese; substratspecificity; optimum pH and temperature; inactivation; inhibition.