Yönlendirilmiş mutagenez ile mutant HCAII geninin eldesi ve mutant proteinlerin inhibitörlere karşı ilgisinin araştırılması

Abstract

Karbonik anhidraz enzimleri (Karbonat hidroliyaz, CA, E.C.4.2.1.1), CO2 ve H2O'denHCO3- iyonlarının geri dönüşümlü reaksiyonunu katalizleyen bir enzim ailesidir.?, ß, ?, ? ve ?-CA olarak bilinen evrimsel olarak ilgisiz beş CA gen ailesi vardır.Hayvanlar alemindeki bütün CA'lar ? tipindedir. İnsanları da kapsayan yüksek omurgalılarda,çok farklı hücresel yerleşimler ve doku dağılımları ile 14 farklı ?-CA izoenzimi saptanmıştır.HCAII enzimi asetazolamid, sulfonamid, metazolamid ve diklorfenamid gibiglaucoma tedavisinde kullanılan ilaçların hedefidir. Fakat sulfonamidlerin 14 izoformu içerenCA izoenzimlerine karşı spesifikliği düşüktür ve ilgili hastalıkların tedavi sürecinde yanetkilerle karşılaşılabilir. Bu yüzden enzimin inhibisyon mekanizmasının daha spesifikinhibitörlerin geliştirlmesi için aydınlatılması önemlidir.Bu çalışmanın amacı katalitik merkezle ilgili olan bazı amino asitleri ortayaçıkarmaktır. PCR'a dayalı olarak kullanılan yönlendirilmiş mutagenez, Asparajin67aminoasiti hidrofob Izolösin amino asitiyle, Lösin204 aminoasiti hidrofil Serin aminoasiti iledeğiştirilmesinde kullanılmıştır. Mutant ve yabani tip proteinlerin ekspresyonu E.coli'deoptimize edilen koşullarda IPTG kullanılarak yapıldı. pET31b vektörü içerisindeki mutantHCAII proteinlerinin ekspresyonu BL21 hücrelerinde IPTG indüksiyonu ile yapıldı. Ekspreedilen proteinlerin saflaştırılması CA spesifik afinite kromatografisi ile yapıldı. Mutant veyabani tip enzimlerin saflıkları SDS-PAGE elektroforezi ile kontrol edildi. Ekspre edilenproteinlerin miktarları Breadford yöntemi ile hesaplandı. Mutant ve yabani tip enzimlerin CO2hidratasyon aktivitesi ölçüldü. Mutant ve yabani tip enzimlerin, glaucoma hastalığıtedavisinde yaygın olarak kullanılan inhibitörlere (sülfonamid ve asetazolamid) karşıinhibisyonları ve IC50 değerleri belirlendi.Asn67Ileu mutant HCAII enziminin 2,1x10-5 M ve 0,0285 x10-3 mM olan IC50değerleriyle mutant enzime göre inhibisyonu daha fazla olarak gözlendi. Tersine Leu204Sermutant enzimin asetazolamid ve sülfonamid inhibitörlerine karşı inhibisyonu 2,52 x10-5 M ve0,422 x10-3 mM IC50 değerleriyle daha düşük olarak tespit edildi.Anahtar sözcükler : HCAII, yönlendirilmiş mutagenez, ekspresyon, saflaştırma, inhibisyon

Carbonic anhydrases (CAs) are a family of enzymes which catalyse the reversiblereaction from H2O and CO2 to HCO3- ions. There are five evolutionarily unrelated CAfamilies, designated ?, ß, ?, ? ve ?-CA. All known CAs from the animal kingdom are of thealpha type. There are fourteen mammalian CA isozymes with different tissue distributions andintracellular locations, in higher vertebrates, including human.The HCAII enzyme is the target for drugs, such as acetazolamide, methazolamide anddichlorphenamide for the treatment of glaucoma. However, since the specificity ofsulphonamides against CA enzymes that consist of 14 isoforms is low, the adverse effectcould be encountered during the treatment of the related diseases. Therefore, it is important toto elucidate the inhibition mechanism of the enzyme in order to develop more specific novelinhibitors.Thus, the aim of the study is to identify some amino acids that may be involved incatalytic centre. PCR Site directed mutagenesis strategy has been performed replacing Asn67to a hydrophobic amino acid, Isoleucin and Leu204 to hydrophilic amino acid, Serin. Theexpression of the mutant protein was performed in E coli with the optimized condition byinducing IPTG. Mutant HCAIIs in pET31b vector were expressed in BL21 cells by includingIPTG. The expressed proteins were purified by CA specific affinity chromatography. Integrityof mutant and wild type enzyme was checked by SDS-page analysis. Bradford assay wasperformed for determination of concentrations of expressed proteins. CO2 hydration activityof mutant and wild-type enzymeswas performed. Inhibition of these mutant and wild typeenzyme was determined by IC50 values against some inhibitors (sulphonilamide andacetozolamide) widely used for the threatment of glaucoma.Asn67ILeu mutants has higher inhibition affinity than wild type with IC50 values of2,1x10-5 M, 0,0285 x10-3 mM. In contrast Leu204Ser mutant has lower affinity tosulphonilamide and acetozolamide than the wild-type HCAII with 2,52 x10-5 M, 0,422 x10-3mM.Key words : HCAII, site directed mutagenesis, expression, purification, inhibition