CB1954 ilaç öncül madde ve nitroredüktaz (NTR) enzim kombinasyonlarının kanser hücrelerine etkisi

Abstract

Son yıllarda kanser tedavilerinde önemi artan enzim/ilaç öncül terapisi (Enzyme/Prodrug Therapy-EPT) dışarıdan gönderilen enzim aracılığıyla ilaç öncü maddesinin aktifleşmesi sonucu kanser hücrelerinin DNA'sının hasara uğrayıp hücrenin ölmesi prensibine dayanır. Nitroredüktazlar (NTR) bu amaç doğrultusunda kullanılan enzimlerdir. Nitroredüktazlar, aktif olmayan ilaç öncül maddesini sitotoksik DNA çapraz bağlayıcı ajan olan aktif forma dönüştürürler.Enzim odaklı kanser terapilerinde en bilinen örnek E.coli NTR ile CB1954 (5-aziridinyl-2,4-dinitrobenzamid) kombinasyonunun kullanılmasıdır. NTR tarafından CB1954 aktivasyonu sonucu hidroksilamin türevleri oluşmakta ve bunlar asetil CoA gibi tiyoesterlerle daha fazla reaksiyona girerek DNA reaktif maddelerini oluşturmaktadır.Tez çalışmasında, Gebze Yüksek Teknoloji Enstitüsü, Kimya Bölümü'nde ilk kez S. saprophyticus suşundan izole edilmiş olan Nitroredüktaz enziminin CB1954 ilaç öncü maddesi ile kombinasyonları serviks epitelyal kanser hücrelerine (HeLa hücreleri) uygulanmış ve sitotoksik etkisi doz ve zamana bağlı olarak incelenmiştir. Farklı enzim ve ilaç öncü konsantrasyonlarının kullanıldığı EPT uygulamaları ardından yapılan hücre canlılığı deneyleri sonucunda, ilaç öncü konsantrasyonu arttığında doz bağımlı sitotoksisite gözlenmiştir. Sitotoksisite deneylerine göre 100 µM CB1954 hücre canlılığını %27'ye düşürürken 10 µM CB1954 ise hücre canlılığını %67,8'e düşürmüştür. EPT uygulamaları ardından apoptozis tayininde ise Akan Hücre Ölçer (Flow Cytometry) kullanılmıştır. Anneksin V antikorunun apoptozise uğrayan hücrelerin membranına bağlanma potansiyelinin tespit edildiği yöntemde, sitotoksisite deneyleriyle benzer sonuçlar elde edilmiştir. İlaç öncülünün konsantrasyonu 10 µM iken %46,3 oranında apoptozis tetiklenirken, 100 µM iken %63,6 oranında tetiklenmektedir. Sonuç olarak NTR/CB1954 kombinasyonları doz artışına bağlı olarak HeLa hücrelerinde apoptozis ve sitotoksisiteyi tetiklemiştir.Anahtar kelimeler: Enzim/ilaç öncü terapisi, ilaç öncü madde, nitroredüktaz, CB1954

Enzyme/Prodrug Therapy (EPT) is a novel approach of cancer therapy in recent years depends on activation of an administered prodrug by an exogenous enzyme which is capable of converting prodrug to active drug causing DNA damage and cell death of cancerous cells. Nitroreductases (NTR) are enzymes used for this purpose. Nitroreductases converts inert prodrug to a DNA cross-linking agents are cytotoxic and active in tumors.NTR isolated from E.coli and CB1954 (5-aziridinyl-2,4-dinitrobenzamid) combination is the most known pattern focusing enzyme cancer treatment. CB1954 activation by NTR generates hydroxylamine derivatives producing DNA reactive matters by further reactions with thioesters such as Acetyl Coenzyme A.In our study, we investigated dose and time related cytotoxic efficiencies of NTR enzyme supplied from Biochemistry Department, Gebze Institute of Technology combined with prodrug CB1954 on cervical ephitelial cancer cells (HeLa cells). The NTR enzyme have been isolated and purified from S. saprophyticus strain and used in enzyme/prodrug therapy for the first time. According to the results dose dependent cytotoxicity have been observed from different combinations and concentrations of enzyme and prodrug by cell viability experiments. Cytotoxicity experiments show that cell viability decreased to 27% by 100 µM concentration of CB1954 and 67,8% by 10 µM CB1954. On the other hand, Flow Cytometry analysis is used for programmed cell death (apoptosis) detection after application of EPT. Binding potantial of Annexin V to the apoptotic cell membrane is determined by Flow Cytometry giving the similar results to cell viability assay. When 100 µM concentration of prodrug is combined with enzyme apoptosis is induced much more effectively (%63,6 ) than 10 µM prodrug concentration (%46,3) on HeLa cells. As a result apoptosis and cytotoxicity is induced by NTR/CB1954 combination depending on dose increase.Keywords: Enzyme/prodrug therapy, prodrug, nitroreductase, CB1954