Zeytin tahmini DnaJ geninin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada zeytin bitkisinde (Olea europaea L.) kasım ayı meyveli yapraklardan oluşturulmuş cDNA kütüphanesinden izole edilen tahmini DnaJ geninin moleküler analizi yapıldı. Gen, çeşitli biyoinformatik araçlar yardımıyla analiz edilerek nükleotid ve aminoasit kompozisyonları ve açık okuma çerçevesi belirlendi. Ayrıca proteinin korunmuş bölgeleri ile hücre içerisindeki lokalizasyonu tahmin edildi. İntron bölgelerinin tespiti amacıyla değişik primer kombinasyonları kullanılarak PCR reaksiyonları gerçekleştirdi. Polimorfizm analizi için zeytin çeşitlerine ait yaprak örnekleri Edremit Zeytincilik Fidan Üretme İstasyonu'nun zeytin bahçesinden toplandı ve özgül primerlerle PCR yapıldı. Var yılı ve yok yılı olarak isimlendirilmiş zeytin ağaçlarından 12 ay boyunca doku örnekleri toplandı. Dokusal ve zamansal ekspresyon seviyesini belirlemek amacıyla çeşitlerden RNA izole edilerek anlık gösterimli (real - time) PCR çalışmaları gerçekleştirildi. Analizler sonucunda tahmini DnaJ geninin 433 aminoasit uzunluğunda bir protein kodladığı tespit edildi. Bu genin kodladığı proteinin yüksek oranda serin ve glisin aminoasitleri ihtiva ettiği görüldü. İntron analizi sonucunda biri yaklaşık 1 kb diğeri de yaklaşık 2 kb büyüklüğünde 2 intron tespit edildi. 400 bç'lik bölgede çok sayıda tek nükleotid polimorfizmlerine rastlandı. Özellikle Koroneiki, Samanlı, Edincik su, Karamürsel Su, Çakır çeşitlerinde SNP'lerin bulunduğu bölgede heterozigot noktalar tespit edildi. Anlık gösterimli (real ? time) PCR analizleri zeytin DnaJ geninin soğuk stresinde görevli olabileceği sonucunu işaret etmektedir. Yaprak, çiçek, tomurcuk ve sürgün gibi dokularda DnaJ geni ifade seviyeleri arasında belirgin bir farklılığa rastlanmazken meyve dokusundaki analizlerde ise çok daha yüksek seviyelerde mRNA sentezinin olduğu ve meyve olgunlaştıkça mRNA miktarının arttığı tespit edildi.ANAHTAR SÖZCÜKLER: Zeytin, DnaJ, ısı şoku proteini, intron, anlık gösterimli (real ? time) PCR, polimorfizm analizi, SNP.

In this study, molecular and physiological analysis of olive putative DnaJ gene isolated from cDNA library which has been generated from olive plant?s (Olea europaea L.) leaves in November were studied. The putative gene was analyzed with many bioinformatics tools. The nucleotide, amino acid compositions, and the open reading frame were determined. In addition, the localization of the protein in a cell, and conserved domains have been estimated. PCR reactions were carried out using different primer combinations in order to determine intron regions. Leaf samples of olive cultivars were collected from Edremit Olive Tree Breeding Station, and PCR was performed with the specific primers for polymorphism analysis. Tissue samples were collected from olive trees that were identified as ?off year? and ?on year? for 12 months. RNAs were isolated from olive tissues and real - time PCR analyses were performed in order to determine the level of spatial and temporal expression. As a result of the analyses, it was determined that DnaJ gene encodes a protein which is 433 amino acid - long. The putative protein contains a great number of glycine and serine amino acids. In intron analysis, at least two introns (one 1 kb and one around 2 kb) were found. A large number of single nucleotide polymorphisms were found in a 400 bp region. Especially, Koroneiki, Samanli, Edincik Su, Karamürsel Su and Çakır cultivars have heterozygous SNPs. Real - time analysis suggested that the olive DnaJ gene could be responsible for cold stres response. Between DnaJ gene expression levels of leaves, flowers, buds, and shoot tissues no significant difference was observed. According to the fruit tissue analysis, gene expression was much higher than the other tissues and it increased as the fruit matured.KEYWORDS: Olea, DnaJ, heat shock protein, intron, real ? time PCR, ploymorphism analysis, SNP.