Zeytin tahmini triozfosfat izomeraz geninin moleküler karakterizasyonu

Abstract

Bu çalışmada; Ayvalık zeytin çeşidine (Olea europaea L. cv. Ayvalık) ait Kasım ayındaki meyve örneklerinden saflaştırılan toplam RNA kullanılarak yapılan cDNA kütüphanesinden izole edilen tahmini triozfosfat izomeraz geninin moleküler analizi yapıldı. Triozfosfat izomeraz (TIM); dihidroksi asetonfosfat ile D-gliseraldehit-3-fosfat arasında tersinir olarak işlev gören katalitik aktivatör bir enzimdir. Hızlı ve verimli enerji üretiminde görev aldığından hemen hemen tüm canlılarda bulunur. Hayvanlar, bitkiler, bakteriler, böcekler, memeliler ve mantarlar dahil olmak üzere birçok canlıda korunmuş formdadır. Çeşitli biyoinformatik araçlarla analiz edilen triozfosfat izomeraz geninin; yaklaşık 1176 nükleotit uzunluğundaki mRNA'sının 254 amino asit kodlayan bir açık okuma çerçevesi (ORF) bulundurduğu, kısa bir 5'UTR (19 nükleotit) ve çok uzun (23 nükleotitlik Poli A kuyruğu hariç 367 nükleotit uzunluğunda) bir 3'UTR içerdiği, moleküler ağırlığının 29044.44 Dalton olduğu ve izoelektrik noktasının da yaklaşık 5.36 olduğu tespit edildi. Triozfosfat izomerazın, stoplazmik TIM enzimlerinin homoloğu olmasına rağmen; valin ve alanin içeriği sırasıyla %11 ve %12 olmak üzere toplam %48 hidrofobik amino asit içermesi dikkat çekmektedir. Zeytin çeşitleri arasında yapılan dizilemeler bu gende polimorfizm oranının çok düşük olduğunu gösterdi. Ayrıca zeytin triozfosfat izomeraz geninde introna rastlanmadı. Zeytinde ilk defa uygulanan TAIL - PCR ile tahmini promotör bölgesinden yaklaşık 350 nükleotitlik dizi tespit edildi. Tahmini genin dokusal ve zamansal ekspresyon seviyesini belirlemek için 12 ay boyunca toplanan zeytin örneklerinden elde edilen RNA'lar ile real - time PCR yapıldı. Genin meyvede sentezlendiği aylara göre bakıldığında ise; Kasım ayında oluşan olgun meyvede en çok sentezlendiği saptandı. Farklı zeytin çeşitlerinin meyveleri arasında yapılan ekspresyon analizi sonucunda da ?İzmir Sofralık? zeytin çeşidinde en fazla bulunduğu görüldü.ANAHTAR KELİMELER: Zeytin, triozfosfat izomeraz, intron analizi, promotör, polimorfizm analizi

In this study, a putative olive triosephosphate isomerase (TIM), isolated from a cDNA library constructed from olive (Olea europaea L.) fruits in November, has been analyzed. BLAST analysis of the cDNA sequence in NCBI databases revealed it has homology to triosephosphate isomerases from various plants. Triosephosphate isomerase is an enzyme that acts as a catalytic activator between D-glyceraldehyde-3-phosphate and dihydroxyacetone phosphate. TIM plays an important role in several metabolic pathways and is essential for efficient energy production. It occurs as a conserved form at animals, plants, bacteria, insects, mammals and fungi. Analysis using various bioinformatics tools revealed that the putative triosephosphate isomerase gene had an approximately 1176 nucleotides long mRNA that encodes a 254 amino acid long open reading frame (ORF). It was estimated to have a molecular weight of 29044.44 Daltons. It contains a short 5' UTR (19 nucleotides) and a long (367 nucleotides in addition to 23 nucleotides Poly A tail) 3' UTR. The isoelectric point of the putative triosephosphate isomerase was calculated as 5.36. Although the putative triosephosphate isomerase had homology to cytosolic TIMs, its 48% hydrophobic content including 11% valine and 12% alanine is noteworthy. Experimental studies suggested that polymorphism is not found among olive cultivars. No introns of the putative gene were detected. With this study, TAIL-PCR was applied for the first time in olive to determine the promoter region of the putative triosephosphate isomerase, and a portion of approximately 350 nucleotides was detected. Spatial and temporal expression patterns of its mRNA were detected using real ? time PCR from total RNA of olive samples collected montly for a year. Real ? time PCR analysis revealed olive putative TIM had the highest expression level in November. Expression analysis among fruits of different cultivars revealed ?İzmir Sofralık? had the highest TIM mRNA level.