Identification of U11/U12 di-snRNP proteins contacting the 5` splice site of a U12-type intron by UV crosslinking studies

Abstract

U12-TIP INTRONUN 5' KIRPILMA YERİNDE TEMASI BULUNAN U11/U12 di-snRNP PROTEİNLERİN UV ÇAPRAZ- BAĞLAMA YÖNTEMİ KULLANILARAK TANIMLANMASI Aynur ÇIKCI Yüksek Lisans Tezi- Biyoloji Mayıs 2003 Tez Yöneticisi: Yrd. Doc. Dr. Ghazi O. Tadmouri Yardımcı Tez Yöneticisi: Dr. Cindy L. Will ÖZET Pre-mRNA'mn uçlarının birbirine eklenmesi esnasında, 5' kırpılma yerinin tanınması oldukça önemli bir adımdır ve birçok RNA-RNA, RNA-protein ve protein- protein ilişkisi içerir. Bugüne kadar minör spliceosomevca. 5- ss tanıma mekanizması ile ilgili bilinenler oldukça kısıtlıdır. Bu calişmada, U12-tip spliceosome` un oluşum aşamasında, UV çapraz bağlama yöntemi kullaılarak, U12-tip intronun 5' kırpılma yerinde kontağı plan U11/U12 di-snRNP proteinlerin tanımlanması amaçlanmıştır. Bu nedenle, Moore ve Sharp ligasyon yöntemi kullanılarak 32P ile işaretlenmiş bir nükleotit ve 5' kesim yerine yakın bir yerde 4-thiouridin içeren kısaltılmış U12-tip pre-mRNA dizimi başarıyla oluşturulmuştur. Birleştirme kompleksinin ilk aşaması olan A kompleksi' nin yapımından sonra, reaksiyon UV ışığı altmda tutulmuştur. Böylelikle, birbirine çapraz bağlanan polipeptid ve RNA karışımı, RNAse Tl enzimi ile kesildikten sonra SDS-P AGE metodu ile incelenmiş ve bağlanan proteinlerin yalnız H kompleks proteinlerine benzedikleri görülmüştür. Ortamdaki spesifik olarak bağlanmiş A kompleks proteinlerinin miktarını arttırmak, ve H ve A komplekslerini birbirinden ayırmak için immunopresipitasyon, gliserol gradyent ve jel filtrasyon teknikleri uygulanmış, ve jel filtrasyon tekniği ile daha başarılı bir ayrıştırılma görülmüştür. A kompleksini içeren fraksiyonlarda belirgin miktarlarda H kompleksinin olması, çapraz bağlanmış spesifik A kompleksinin gözlemlenmesine engel olmuştur, immunopresipitasyon yöntemiyle U11/U12 di-snRNP` ye karşı özel antibodiler kullanarak çapraz bağlanan proteinleri tanımlama girişimi bu aşamada başarısız olmuştur. Yinede, ileride bu yöntemi kullanarak yapılacak deneyler, bize U12-tipi spliceosornxm oluşum mekanizması hakkında hem daha fazla bilgi verecek, hemdeVI U12-tip pre-mRNA-protein ilişkisi açısından daha ayrıntılı biyokimyasal bilgiye ulaşmamızı sağlayacaktır. Anahtar Kelimeler A kompleks, U11/U12 snRNP, RNAse Tl, 5' kırpılma yeri, SDS-PAGE, UV çapraz bağlama, U12-tip intron, hnRNP, 4-thiouridin.

m IDENTIFICATION OF U11/U12 di-snRNP PROTEINS CONTACTING THE 5' SPLICE SITE OF A U12-TYPE INTRON BY UV CROSSLINKING STUDIES Aynur ÇIKCI M.S. Thesis-Biology May 2003 Supervisor: Assistant Prof. Ghazi O. Tadmouri Co-Supervisor: Dr. Cindy L. Will ABSTRACT 5' splice site (ss) recognition is a crucial step in pre-mRNA splicing and it involves multiple RNA-RNA, protein-protein and protein-RNA interactions. Currently, little is known about the mechanism of 5' ss recognition in the minor spliceosome. The aim of this study was to identify Ull/U12snRNP proteins contacting the 5' ss of a U12-type intron during the early stages of spliceosome assembly by performing UV crosslinking. For this purpose, a U12-dependent, truncated pre-mRNA substrate containing a single 32P-labelled nucleotide and 4-thiouridine at specific sites near the 5' splice site was successfully constructed using the Moore and Sharp ligation method. After allowing for splicing complex A formation, splicing reactions were UV irradiated and the crosslinked polypeptide-RNA moieties were analyzed directly after RNAse Tl digestion by SDS-PAGE. However, the observed crosslinked proteins appeared to represent solely H complex, hnRNP proteins. To enrich for A complex-specific crosslinks, immunoprecipitation, glycerol gradient centrifugation and gel filtration assays were tested to separate H and A complexes. The most efficient separation was observed using gel filtration. However, fractions containing A complex still contained significant amounts of H complex and thus A complex-specific crosslinks could still not be observed. An initial attempt to identify crosslinks by immunoprecipitation using antibodies specific for U11/U12 proteins was unsuccessful. However, future results using this method should not only improve our understanding of the minor spliceosome assembly process, but they will also provide detailed biochemical information regarding U 1 2-typ e pre-mRN A-protein interactions.IV Keywords: A complex, U11/U12 snRNP, RNAse Tl, 5' splice site, SDS-PAGE, UV crosslinking, U12-type intron, hnRNP, 4-thiouridine.