A molecular genetic approach to the quantitative analysis of processed meat by real-time PCR tecniques and rapid identification of the species origin of meats in foodstuff by multiplex PCR

Abstract

Son zamanlarda gıda ürünlerinin özellikle de et ürünlerinin kompozisyonuyla ilgili çok daha ötede bilgi ihtiyacının olması karışık-işlenmiş gıdaların içinde bulunan etlerin tür orijinlerinin belirlenmesi ve miktarlarının ölçülmesi, toplum yasalarının uygunluğuyla altı çizilen gıda denetlemeleri için önemli bir hedefi temsil etmektedir. Bu yüzden gıdanın etiketleme gereksinimiyle uyumluluğunu doğrulamak, türünü tanımlamak ve miktarını ölçmek için sipesifik, hassas ve kolay analitik metotlara ihtiyaç vardır. Bu çalışmada bu gereklilikten dolayı compleks gıda matrikslerinde bulunan etlerin miktarı ve orijinlerinin analizleri için DNA temelli teknikler olan konvensiyonel çoklu zincir çoğaltma reaksiyonu (CM-PCR), kantitatif gerçek zamanlı zincir çoğaltma reaksiyonu (QRT-PCR) ve çoklu gerçek zamanlı zincir çoğaltma reaksiyonu (MRT-PCR), geliştirildi ve optimize edildi. Ve aynı zamanda kasıtlı olarak eklenen etlerin varlığını ve oranlarını elde etmek için bu teknikler kullanıldı.CM-PCR tekniği gıda maddelerinde en çok kullanılan ruminant, kanatlı, balık ve domuz gibi türlerin identifikasyonu için çiğ ve işlenmiş etlere mitokondrial DNA'nın farklı bölgelerine dizaynedilmiş türe özgü primerler GenBank veri tabanlarında elde edilebilir sekansların sıraya konulmasından sonra kullanıldı. Bu primerler kanatlı için 183, balık için 224, domuz için 290 ve ruminant için 374 baz uzunluğunda spesifik frakmantlar üretti. Optimize edilen CM-PCR piyasadan satın alınan 93 et ürününe uygulandı ve analiz edilen çiğ ve işlenmiş kırmızı etlerin %50 sinde tavuk eti olduğu böylece içerisinde etiketinde işaret edilmeyen hayvan türlerinin varlığı kanıtlandı. Ve aynı zamanda bütün multiplex reaksiyonlaı test edilen 71 numunenin 25 (%35.1) inin beklenmeyen sonuçlar verdiğini gösterdi. Ancak bu varlığın üretim esnasındaki rasgele bir kontaminasyon mu yoksa kasten katılmış et mi olduğuna karar verilemedi. Bu dezavantajdan dolayı SYBR Green temelli bir algılama sistemi kullanılarak QRT-PCR geliştirildi.QRT-PCR'ın minimum etkili kantitatif düzeyi ruminant için 0,00006 ng/µl,kanatlı için 0.000076 ng/µl, balık için 0,000045 ng/µl ve domuz için 0,000075 ng/µl idi. Bu teknik kullanılarak ticari olarak satın alınmış 93 et örneği içerisinde ki işlenmiş 9 et ürünü test edildi. Ruminant et oranları dilüsyon standart eğri serileriyle karşılaştırıldıktan sonra tahmin edildi. Ruminant et oranları için sonuçlar karışık-şlenmiş etlerinin defolu olduğunu ve içerisinde, ruminant etlerinin yerine önemli ölçüde ana komponent olarak kanatlı etlerinin ikame edildiğini gösterdi. Çünkü test edilen karışık-işlenmiş et ürünlerininde ki kanatlı etlerinin oranları etiketlerinde verilen oranlarından daha fazlaydı bunun aksine ruminant etlerinin oranı ise daha azdı.Burda aynı zaman da SYBR Green florasan boyası kullanarak hayvan genlerinin daha hızlı algılanması ve tanımlanması için CM-PCR ve QRT-PCR'ın avantajlarını kombine eden MRT-PCR geliştirildi. Çalışmanın bu kısmının amacı karışık etlerin bir gurubunu eşzamanlı olarak tespit etmek için çift etiketli problardan daha ucuz olan SYBR Green florasan boyası kullanarak hızlı, spesifik ve doğru MRT-PCR yi dizayn etmekti. MRT-PCR sonuçlarımız karışık gıda maddelerinden izole edilen 2 türe ait DNA'nın hızlı bir şekilde tespit edileceğini gösterdi. Şunuda söylemeliyiz ki; SYBR Green florasan boyası kullanarak karışık etlerden izole edilen DNA üzerine uyguladığımız hem QRT-PCR hemde MRT-PCR tekniklerimiz moleküler gıda analizi alanında tekti.Anahtar Kelimeler; PZR, kantitatif gerçek zamanlı PZR, çoklu PZR, etlerin kantitatif analizi, etlerin orjinlerinin tayini, SYBR Green

Recently the need of further information about the composition of food products, in particular of meat products, is increased, so identifying the species of origin of meat products and quantifying the amount of meat in mixed-processed products represent a substantial target for food inspection, underlined by the enforcement of community laws. Thus, specific, sensitive and easy analytical methods for the species detection and quantitation of food are necessary in order to verify the compatible with labelling requirements. For this necessity in this study, DNA-based tecniques, CM-PCR(conventional multiplex PCR, QRT-PCR(quantitative real-time PCR), MRT-PCR(multiplex real-time PCR) were developed and optimised for the analysis of origin and quantification of meats in complex food matrix. And also these tecniques were used to evaluate the ratios and presence of fraudulently added meat.CM-PCR assay was applied to precessed and raw meats for the identification of the most used species in foodstuffs such as ruminant, poultry, fish and pork meterials. Specific-species primers designed in different regons of mitocondrial DNA were used after alignment of the available sequences in the GenBank database. The primers generated specific fragment of 183, 224, 290 and 374 bp length for poultry, fish, pork, and ruminant, respectively. The optimised CM-PCR assay was applied to 93 commercial meat products and it showed the presence of poultry meat in %50 of the analyzed products contain raw or processed red meat, evidenced the presence of animals species not indicated on the label. And also, overall multiplex results showed that 25 (35.1%) among 71 tested samples gave unexpected results (Table 12) not indicated in their labels. Clearly, we couldn?t decide whether they are contamination or intentional admixture at the moment of the manufacturing of these products. Because of this drawback we developed QRT-PCR assay for poultry and ruminant using SYBR Green based-detection system.The minimum effective quantification levels of QRT-PCR were 0,00006 ng/µl, 0.000076 ng/µl 0,000045 ng/µland 0,000045 ng/µl for ruminant , poultry ,fish and pork respectively. Also, processed 9 meat tested in commercially purchesed 100 meat products using this assay. The ruminant meat proportions were predicted after comparing with the standart dilution series. The results for proportion of ruminant showed significantly ruminant meat defectived and there was DNA of poultry especially instead of mammals DNA in the mixed-processed meats as the main component. Because, the amount of poultry meat was more than the ratios given on it?s label in processed-mixed meat products on the contrary ruminant meat proportion was less than.Also MRT-PCR was developed here was done to improve an assay that can combine the two advantages of real-time PCR and multiplex PCR together for animal gene detection and identification more quickly. The objective of this part of study was to design a rapid, specific and accurate MRT-PCR assay by using SYBR Green fluorescence dye cheaper than duble labeled probes to detect a group of mixed meat simultaneously. Our results indicate that our multiplex real-time PCR assay can be used to more quickly identify DNAs isolated from complex foods. We should tell that our both QRT-PCR and MRT-PCR assays applied on the DNAs of the complex meat matrix using SYBR Green florescence was first one in the field of molecular food analysis.Keywords; PCR, Quantitative real-time PCR, Multiplex PCR, quantitative analysis of meat, identification of origin of meats, SYBR Green