Selective silencing of DNA topoisomerase IIß by siRNA transfection during neural transdifferentiation of hMSCs

Abstract

İnsan kemik iliğinden izole edilmiş olan mezenkimal kök hücreler nöral hücreye transfarklılaşma potansiyeline sahiptirler. Bu çalışmada nöral farklılaşma N3 sitokin karışımı ile sağlandı. Farklılaşma esnasında bazı genlerin ifadesi tekrar düzenlenip, bazılarının da ifadesi artmaktadır. DNA topoizomeraz IIß enziminin de miktarının farklılaşma esnasında arttığı bilinmektedir. Fakat nöral farklılaşma esnasındaki rolü tam olarak bilinmemektedir. DNA topoizomeraz IIß enziminin nöral farklılaşma esnasındaki rolünü belirleyebilmek için TOPO 2B genini RNA interferans yöntemiyle spesifik olarak susturmaya karar verildi. siRNA'yı hücreye verebilmek için Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX, FuGENE HD ve Primefect gibi çeşitli transfeksiyon ajanları denendi. Bu ajanların çoğu HEK 293 ve HUVEC hücre hatlarına GFP plasmidinin ve işaretli siRNA'nın girişini sağladı fakat mezenkimal kök hücrelerde başarılı bir sonuç elde edilemedi. TOPO 2B genine özgü siRNA'nın mezenkimal kök hücrelere Lipofectamine RNAiMAX transfeksiyon ajanıyla verilmesi sonucunda yeterli susturma sağlandı.

Mesenchymal stem cells derived from human bone marrow have a potential to transdifferentiate into neural cells. In this study the differentiation was achieved by N3 cytokine combinations. During differentiation process several genes are up regulated. Previous studies claims that, this increase in expression level is provided by the act of DNA Topoisomerases. Also it is known that the amount of DNA Topoisomerase IIß enzyme increases during differentiation processes. However the effect of it during neural differentiation is not clear. In order to reveal this we decided to silence DNA topoisomerase IIß specifically by RNA interference mechanism. To achieve this silencing we used several siRNA delivery reagents such as Lipofectamine 2000, Lipofectamine RNAiMAX, FuGENE HD and Primefect transfection reagents. Most of them delivered both GFP plasmid and siRNA into HUVEC and HEK 293 cell lines successfully. However to deliver GFP plasmid and labeled siRNA into hMSCs was not possible. Fortunately we were successful to deliver target specific siRNA (TOP 2B specific) into hMSCs with Lipofectamine RNAiMAX siRNA delivery reagent.