Molecular and microbiological investigations of the metal reducing bacteria Shewanella putrefaciens

Abstract

Shewanella putrefaciens birçok metali indirgeme özelliği dolayısıyla hem biyorimediyasyon hem de anaerobik ortamda üretmiş olduğu elektronları sayesinde biyoteknolojik açıdan oldukça fazla öneme sahip bir mikroorganizmadır. Birçok besin ortamında ve oldukça düşük sıcaklıklarda, oksijenli ve oksijensiz ortamlarda ve birçok yerde rahatça yaşayabilmesi bu mikroorganizma ile çalışılmasını kolaylaştırmıştır. E. coli ile olan benzerlikleri kullanılarak yapılan çalışmaların olabilirliğini tahmin etmek daha da kolay olacaktır.Bu çalışmada, elektrik ürettiği birçok bilimsel araştırmada ortaya konmuş bu mikroorganizma üzerinde çeşitli genetik manipulasyonlar ile elektrik üretim miktarı arttırılmak istenmiştir. Öncelikle hangi gen üzerinde çalışılacağı tespit edilmiş ve bu amaçla Aspergillus niger küfünden izole edilen genomik DNA kullanılarak glikoz oksidaz geni uygun primerler ile çoğaltılmıştır. Amaca uygun olarak seçilen vektör ve transforme edilecek hücre ile glikoz oksidaz geni klonlanmaya ve uygun E. coli suşunda klonlanan gen ekprese edilmeye çalışılmıştır. Protein ekpresyon deneylerinde pozitif bulunan klonlardan izole edilen plazmitler elektroporasyon ile Shewanella putrefaciens' e aktarılacak ve yine bu canlı içerisinde de proteinin ekpresyonu gözlenmeye çalışılacaktır.Yapılan birçok denemeden sonra genin vektor içerisine klonlanması oldukça fazla zaman almıştır. Bulunan pozitif klonların ekpresyon suşlarına aktarılıp, protein indüklemesi deneylerinden sonra yapılan SDS-PAGE protein jelinde pozitif çıkmadıkları görülmüştür. Tekrar başa dönülüp yeni klonlamalar ve yeni pozitif klonlar elde edilmeye çalışılmıştır. Son olarak seçilen E. coli BL21(DE3) pLysS suşu ile yapılan IPTG ile protein indükleme çalışmasında istenilen sonuç alınmıştır. Ancak bu aşama çok vakit aldığından üzerinde çalışılması planlanan mikroorganizmaya aktarımı sağlanamamıştır.Anahtar Kelimeler: Shewanella putrefaciens ATCC 8071, Elektrik, Güç Üretimi,Mikrobiyal Yakıt Hücresi, Glikoz Oksidaz, Klonlama, Aspergillus niger

Shewanella putrefaceins is a metal reducing bacterium which can use a diversity of organic compounds and metals to obtain the energy needed for its growth. It is a Gram negative , facultative anaerobic bacterium, related to E. coli. The tools and techniques that were developed over the past 30 years for E. coli are compatible with S. Putrefaciens. Furthermore, the ability of Shewanella to tolerate oxygen allows easy genetic manipulation in contrast to strict anaerobic bacteria. In this work we try to engineer a recombinant Shewanella putrefaceins as a new and efficient system for producing electricity.For further molecular cloning studies and strategies a suitable expression system of this enzyme should be investigated to overcome its weak expression in the E. coli host organism. Three heterologous expression systems were used up to now. The last one, E. coli BL21 (DE3) pLysS, was found more efficient during pilot protein expression studies because of codon usage bias.In the present work a few constracts were created in order to find the more efficient one for heterologous expression of Aspergillus niger glucose oxidase in E. coli host cells. .Based on the codon preference, the bacterium E. coli BL21 (DE3) pLysS was selected as the best potential host for Aspergillus niger glucose oxidase expression. A significant increase in expression level of recombinant glucose oxidase was observed for strain BL21 instead of Top 10 or HB 101. This shows that the system of E. coli BL21 (DE3) pLysS heterologous production system for fungal gene, glucose oxidase appears more efficient than Top 10 and HB 101 strains.Keywords: Shewanella putrefaciens ATCC 8071, Electricity, Power Generation, Microbial Fuel Cell, Glucose Oxidase, Cloning, Aspergillus niger