RAPD-PZR analizinde, primer bağlanma derecesi ve dna konsantrasyon parametrelerinin optimizasyonu ile farklı canlı ve doku tiplerinde DNA değişiklerinin tespiti

Abstract

RAPD-PZR yöntemi DNA değişikliklerini çeşitli açılardan tespitte 1990'dan beri kullanılan moleküler bir tekniktir. Birçok avantajı olan ve genomik dizileri bilmeden de sadece kısa rastgele dizayn edilmiş primerler kullanılarak elde edilen DNA parmak izlerinin doğru şekilde analiz edilmesi esasına dayalı çok verimli, ucuz bir metottur. Ancak PZR parametrelerinin bu tür çalışmaların sağlıklı yürütülmesi için optimizasyonu çok önemlidir. Hem deneylerin tekrarlanabilirliği, hem güvenilirliği açısından özellikle DNA konsantrasyonu ve primer bağlanma sıcaklığı (AT: Annealing Temperature) ile ilgili optimizasyonlar çok önemlidir. Ancak literatürde bilgimiz dahilinde deneysel olarak bu parametrelerle ilgili kapsamlı bir çalışma mevcut değildir. Bütün araştırmacılar bu tip optimizasyonların farkında olduklarını bildirseler de metodun optimizasyonu ile ilgili bu tür genel bir araştırma yapmaksızın çalıştıkları canlı sistemin deneysel optimizasyonuna yönelik çalışmışlardır. Bu eksikliklerden yola çıkarak metodun geliştirilmesinde çeşitli canlı ve dokuların DNA'sında var olan ya da sonradan oluşmuş DNA değişikliklerini tespit ederken, primer AT ve DNA konsantrasyonlarındaki değişikliklerin etkisinin gösterilmesi ısı gradyan PZR cihazı kullanılarak yapılmıştır. Isı gradyanlı sistem sayesinde 96 örnek kapasiteli PZR bloğu ve uyumlu tabak yardımıyla RAPD-PZR yönteminde hem primer bağlanma derecesinin, hem de DNA konsantrasyonlarının her çalışmanın amaç ve kapsamı doğrultusunda çok ciddi bir şekilde optimizasyonunun şart olduğu aksinin, yani varolan optize edilmiş ve RAPD-PCR kullanıcıları tarafından kabul görmüş optimize şartlarla çalışmanın hatalı sonuçlar verebileceği gösterilmiştir. Çalışmamız sonuçları açısından bundan sonra yapılacak RAPD-PZR çalışmaları için ciddi bir prosedüral katkıda bulunmuştur.

Despite having potential for many applications, the arbitrary nature of the RAPD method has drawn criticism owing to the low stringency conditions and dependance on DNA quality and concentration. Relatively low annealing temperatures (34?36oC) are used in RAPD to ensure a maximal number of primer binding events and consequent generation of a large number of ampli ? ed DNA fragments for analytical purposes. However, the low stringency of the accompanying DNA hybridisation can result in the formation of spurious, unpredictable ampli ? cations. HAT-RAPD applications are also not enough to provide reliable, efficient and effective amplified DNA fragments. In this thesis aim is to show there is a need for right AT optimizations suitable for primer type, primer melt temperature, sample DNA type, quality and quantity and to provide a methodology to make more feasible, reliable, reproducible, repeatable assay designs.A thermal cycler with a gradient temperature property has been used to show the necessary optimizations in RAPD-PCR AT?s for different assay design parameters like DNA type, quality, quantity, primer type and primer Tm. The results are evaluated to provide a methodology for efficient RAPD assay designs with AT and DNA concentration parameters in focus.