Neural differentiation potentiall variability of bone marrow derived human mesenchymal stem cells

Abstract

Hücresel tedaviler içinde kemik iliği kökenli insan mezenkimal kök hücre (iMKH) tedavisi heyecan verici ve hızla gelişen bir tedavi şeklidir. Mezenkimal kök hücrelerin, elde edildikleri dokularda çok az sayıda olmaları nedeniyle in vitro hücre kültür ortamında çoğaltılmalarının gerekliliği ve bu hücrelerin yaşlanan popülasyonda sıkça rastlanan hastalıkların tedavisi için kullanılmaları; klinik çalışmalar öncesi donör yaşı ve uzun süreli pasajlamanın iMKH üzerine etkisinin araştırılmasını gerektirmektedir.Donör yaşının iMKH üzerine etkisini araştıran önceki çalışmalardan elde edilen sonuçların tutarsızlığı, seçilen donörlerin yaşlarının birbirine yakınlığından kaynaklanmaktadır. Çalışmamızda donör sayısını arttırıp, yaş aralığını geniş tutarak bu tutarsızlığı aşmayı amaçladık. iMKH kültürleri çocuk (0-18 yaş, s = 6), yetişkin (18-50 yaş, s = 6) ve yaşlı (50 yaş üzeri, s = 6) donörlerden elde edilmiştir.Bu çalışmada, donör yaşının iMKH'nin; morfolojileri, proliferasyon potansiyelleri ve farklılaşma özellikleri üzerine olan etkisi araştırılmıştır. Aynı zamanda, in vitro kültür şartlarında pasajlanarak çoğlatılmalarının bu hücrelerin karakteristik özellikleri ve nöral trans-farklılaşma potansiyelleri üzerine etkisi değerlendirilmiştir.Farklı yaş gruplarındaki tüm hastalardan izole edilen iMKH'nin; hücresel morfolojileri, çoğalmaları ve farklılaşma potansiyellerinde değişiklikler gözlenmiştir. Çocuk donörlerden izole edilen hücreler fibroblastoid-çubuk şeklindeki hücresel morfolojilerini in vitro koşullarda daha uzun süre korumuş; yetişkin ve yaşlı donörlerden izole edilen hücrelerle kıyaslandığında daha fazla çoğalma eğilimi göstermişlerdir. iMKH'nin adipojenik, osteojenik ve nörojenik farklılaşma kapasiteleri yaşla beraber düşmüş fakat kondrojenik farklılaşma kapasiteleri değişmemiştir.iMKH'nin kültür ortamında pasajlanarak çoğaltılmasının bu hücrelerin; hücresel morfolojileri ve farklılaşma yeteneklerini etkilediği gözlenmiştir. Artan pasaj sayısıyla beraber hücrelerin proliferasyon oranları düşmüş ve hücreler fibroblastoid-çubuk şeklindeki morfolojilerini kaybetmişlerdir. Kültür ortamında pasajlayarak çoğaltmanın hücrelerin nöral trans-farklılaşma potansiyeli üzerine etkisini araştırmak için RT-PZR kullanılarak farklılaşmamış iMKH'nin nöral tanımlayıcılardan NSE ve ß III tubulin gen ifade seviyeleri araştırılmıştır.iMKH'nin kültür ortamında, uygun uyarıcılar olmadan, nöral dokuya özel tanımlayıcıları ifade ettikleri ve her donörün kendine özgün bir ifade modelinin olduğu gözlenmiştir. Çocuk donörlerden izole edilen MKH'nin aksine, yetişkin donörlere ait iMKH'nin, in vitro kültür koşullarında çoğlatılmaları sonucu; artan pasaj sayısına bağlı olarak nöral tanımlayıcı ifade düzeylerinin de arttığı sonucuna varılmıştır.Klinik çalışmalar öncesi, yüksek derecede standardize edilmiş in vitro kültür koşullarında bile, donör yaşının ve hücrelerin uzun süre pasajlanmasının iMKH'nin özelliklerinde farklılıklara yol açtığı göz önünde bulundurulmalıdır.Anahtar Kelimeler: insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreleri, farklılaşma, yaş, nöral trans-farklılaşma, uzun süreli pasaj

Bone marrow derived human mesenchymal stem cells (hMSC) represent a promising cell-based therapy for a number of degenerative conditions. Many promising applications require cell expansion following harvest and involve the treatment of diseases and conditions found in an aging population. Therefore, the effect of donor age and long term passage must be understood in order to develop clinical techniques and therapeutics based on hMSCs.Previous investigations into affects of aging on hMSC have proved contradictory due to the relative narrow age ranges of subjects assessed. This study seeks to address this controversy by increasing donor number and using a wider range of donor ages. We have established cultures of hMSCs from child (0-18 years, n = 6), adult (18-50 years, n = 6) and old (over 50 years, n = 6) donors.In this study, we evaluated the effects of donor age on morphology, proliferation potential and differentiation ability of bone marrow derived hMSCs. In addition we examined effects of long term passage on the characteristics and trans-differentiation potential of hMSCs towards neurogenic lineage.Differences in morphology, cell growth and differentiation potential of hMSCs obtained from donors of different age were observed. Cells from child donors maintained their fibroblast-like morphology up to higher passages and proliferated in a greater number than those from adult and old donors. Adipogenic, osteogenic and neurogenic differentiation potential decreased with age; while chondrogenic potential didn?t change.Long term serial passage affected morphology and proliferation potential of hMSCs from all ages. With increasing passage number, proliferation rate decreased and cells lost their typical morphology. In order to assess effects of long term passage on neural trans-differentiation potential, we have used RT-PCR to investigate expression levels of neural markers (ß III Tubulin,NSE) and topo IIß in populations of non-differentiated hMSCs.hMSCs spontaneously expressed certain neural phenotype markers in culture, without specialized induction reagents. Each donor sample revealed a unique expression pattern, demonstrating a significant variation of marker expression. Marker expression levels increased due to increasing passage number in hMSCs from adult donors, in contrast to hMSCs from child donors.These results indicated that; even under highly standardized culture conditions, donor age and long-term passage have effects on hMSC characteristics, which should be taken into account prior to stem cell based therapies.Keywords: human bone marrow mesenchymal stem cells, differentiation, age, neural transdifferentiation, long term passage