Epitopes mapping of recombinant CagA protein of Helicobacter pylori by anti-CagA monoclonal antibodies

Abstract

Protein epitoplarının spesifik antikorlar ile tanınması antikor-antijen etkilişiminin belirlenmesinde önemli bir basamaktır. Bu epitopların belirlenmesi bağlanma yerlerinin tespit edilmesinde, farklı antikorlar arasındaki karşı reaksiyonların anlaşılmasında ve bu antikorların araştırma ve tanısal alanlardaki kullanımında yardımcı olmaktadır. Bu çalışmadaki amacımız Helicobacter pylori'nin cagA 5' korunmuş bölgesini klonlayarak farklı moleküler ağırlıkta rekombinant CagA (rCagA) proteinleri geliştirmek ve bu geliştirilen proteinlerdeki epitop bölgelerinin kendi ürettiğimiz anti-CagA monoklonal antikorlar ve ticari olan monoclonal antikorlar kullanarak belirlemektir. Rekombinant plazmidimiz olan `pET28a(+)-rCagA`, E.coli BL21(DE3)pLySs hücrelerinden izole edildi ve bu plazmitteki restriksiyon kesim yerleri SnapGene program ile belirlendi. Plazmit vektörü Spe1, AvrII ve Xho1 restriksiyon enzimleri ile üç farklı yerden kesildi ve vektörün kendisine ligasyon yapılarak E.coli BL21(DE3) hücrelerine transformasyonu yapıldı. IPTG indüksiyon sonucu, 67 kDa, 60 kDa ve 28 kDa moleküler ağırlıktaki 3 rCagA protein elde edilerek üzerindeki tahmini epitop sayıları 67 kDa rCagA proteinde ise 14 epitop, 60kDa rCagA proteininde 11 epitop ve 28kDa rCagA proteininde 6 epitop olarak `Emini Surface Accessibility Prediction` yazılımı ile belirlendi. Bu tahmini epitoplar western blot analizinde kendi monoklonal antikorumuz olan BS-53, CK-02 ve 3 ticari anti-CagA monoklonal antikor olan A-10, B-818M, B-237H kullanılarak yapıldı. BS-53 tüm rCagA proteinlerini tanırken, CK-02 ve A-10, 60kDa ve 67 kDa rCagA proteinini tanımıştır. B-818M ve B-237H ise sadece 67 kDa rCagA proteinini tanımıştır. Bu sonuçlara göre, BS-53 tüm rCagA proteinlerindeki ilk 248 aminoasit dizisi içerisindeki bir epitopu tanımaktadır. CK-02, 67 kDa ve 60kDa rCagA proteinlerdeki 248 ile 469'uncu aminoasit dizisi içerisindeki bir epitopu tanımaktadır. A-10 ticari monoclonal antikoru, CK-02 ile aynı bölgedeki bir epitopu tanırken, B-818M ve B-237H monoclonal antikorları, 67 kDa rCagA proteinindeki 469 ile 594'üncü aminoasit dizisinde bulunan bir epitopu tanımaktadır. His-probe monoklonal antikorun western blot analizinde kullanılması ise rCagA proteinlerimizin 6xHistidine işaretli olduğunu bir kez daha doğrulamıştır. Bu çalışma göstermiştir ki, kendi monoklonal antikorlarımız olan BS-53 ve CK-02, rCagA proteininin farklı bir bölgesindeki epitopu tanımaktadır. Böylece, bu monoklonal antikorlar ticari kullanılan monoklonal antikorlara benzer araştırma ve tanısal alanlarda kullanılabilecektir.

The recognition of protein epitopes by specific antibodies is an important step in the antigen-antibody interactions. The detection of such epitopes can help to localize the binding sites, understand cross-reactivity between different antibodies and in the use of such antibodies in research and diagnostics. The aims of this study were to clone the cagA 5' conserved region of Helicobacter pylori, to develop recombinant CagA (rCagA) proteins of different molecular weights and to identify the epitope regions of these proteins using our own anti-CagA monoclonal antibodies (Mabs) and commercial Mabs. The recombinant plasmid `pET28a(+)-rCagA` was purified from E. coli BL21(DE3)pLySs and the restriction cutting sites on this plasmid were designated by the SnapGene program. The plasmid vector was cut with Spe1, AvrII and Xho1 restriction enzymes at three different setups, self-ligated and transformed to E. coli BL21(DE3) cells. After IPTG induction, three rCagA proteins of 67 kDa, 60 kDa and 28 kDa molecular weights were obtained. A predicted number of epitopes on these proteins using the `Emini Surface Accessibility Prediction` software showed 14 epitopes in 67 kDa rCagA protein, 11 epitopes in 60 kDa rCagA protein and 6 epitopes in 28 kDa rCagA protein. The localization of these epitopes on each of these rCagA proteins were done by western blot using our own anti-rCagA Mabs (BS-53, CK-02) and three commercially available anti-CagA Mabs (A-10, B-818M, B-237H, His-probe). We found that our BS-53 Mab recognized all 3 rCagA proteins, our CK-02 Mab and A-10 Mab recognized the 67 kDa and 60 kDa rCagA proteins while the B-818M Mab and B-237H Mab recognized only the 67 kDa rCagA protein. As a result, our BS-53 Mab recognized an epitope localized within the first 248 amino acids of all 3 rCagA proteins. While the our CK-02 Mab recognized an epitope localized in between the 248th and 469th amino acid sequence of the 67 kDa and 60 kDa rCagA proteins. The commercial Mab A-10 recognized an epitope that is localized in the same region as our CK-02 Mab while the B-818M Mab and B-237H Mab recognized an epitope localized in between the 469th and 594th amino acid sequence of the 67kDa rCagA protein. The use of His-probe Mab in western blot further confirmed that the rCagA proteins carry the 6xHistidine tag. This study shows that our own BS-53 Mab and CK-02 recognized epitopes localized on a different region of the rCagA protein. Thus, these Mabs can be used in research and diagnostics similar to the commercially available Mabs.