Subtilizin kinetiği ve etilmetan sülfonatın sporlaşma üzerine etkisi

Abstract

Ill ÖZET Bu çalışmada koyun, keçi inek ve manda gibi farklı tür hayvanların sütlerinden saflaştırılan kazeinler B. subtîlis türlerinden saflaştırılmış ve ticari olarak sağlanan subtilizin için substrat olarak kullanıldı. Spektrofotometrik olarak tayin edilen K^, ve Vmax değerleri, inek sütünden saflaştırılan kazeinlerin diğerlerine nazaran daha iyi bir substrat olduğunu gösterdi. Ulaşılan bu sonuçlar ile kazeinlerin Ca2+ ve (PO4)3- içerikleri arasında bir ilişki kurulmaya çalışıldı. Diğerlerine nazaran Ca2+ ve (PO4)3- oranının inek kazeininde en düşük değere sahip olması, bu iyonların proteine kazandırdıkları rijit yapı nedeniyle enzim-substrat etkileşmesinde etken oldukları kanısını uyandırmaktadır. Enzim için azokol, azokazein ve farklı kaynaklı kazeinler substrat olarak kullanılıp yapılan aktivite tayinlerinden inek kazeininin daha iyi bir substrat olduğu saptandı. Enzim-substrat inkübasyon ortamına uygun derişimlerde tirozin, triptofan, fenol, sistein, etilmetan sülfonat (EMS) ve Hg2+ ve Cu2+ gibi metal iyonlarının farklı tuzlan ilave edilerek kinetik etkileri incelendi. Elde edilen sonuçlardan inkübasyon ortamına ilave edilen bu bileşiklerin yarışmalı bir inhibisyona yol açtıkları saptandı.IV Ayrıca subtilizinin sporlaşma aşamasında salgılanıp salgılanmadığını ve proteaz inhibitörlerinin bakterilerde sporlaşmayı da inhibe edip etmediğini belirlemek için B. subtilis uygun derişimde EMS ile Spinzer besi yerinde 37 °C de 10, 15 ve 20 saat inkübasyona bırakılıp üretildi. Yapılan aktivite tayinlerinde EMS' li kültürlerde subtilizin aktivitesinin kontrolden daha düşük olduğu görüldü. Aynı örneklerin Müzereli Spor Boyası ile boyanması sonucu mikroskop altında elde edilen görüntüler ile kontrolde hiç spor gözlenmezken, EMS' li kültürlerde spor oluştuğu sonucuna varıldı. Bu sonuç subtilizinin sporlaşma aşamasında salgılandığı görüşü ile ve proteaz inhibitörlerinin sporlaşmayı inhibe ettiği görüşü ile de çelişmektedir. EMS' nin bu etkisini belki nükleik asitlerle olan etkileşmesinde aramak ve bu doğrultuda çalışmalar yapmayı gerektirmektedir.

ABSTRACT in this study casein was purified from sheep, goat, cow and water buffalo milk and used as a substrate for purified preparation of Bacillus subtilis subtilisin. On the basis of Km and Vmax value we can say that cow milk casein is the best substrate for the enzyme compared to other animals milk casein. On the other hand we have investigated the possible relationship between the Ca2+ and (PO^3- content of casein and the casein appropriate for the enzyme. The cow milk casein with lower most Ca^/CPO^3- ratio suggest that these ions may have an influence on enzyme-substrate interaction. Azocoll, azocaseine and the caseins from different sources have been used as a substrate for the enzyme, and among these the cow casein was found to be the best substrate. Tyrosine, tryptophan, phenol, cysteine, ethylmethane sulphonate and different salts of Hg2+ and Cu2+ was added to the enzyme-substrate medium in appropriate concentrations to investigate their kinetic effects. These compounds added to incubation medium were found to cause a competetive inhibition.VI Furthermore, Bacillus subtilis was incubated at 37 °C for 10, 1 5 and 20 hours in Spinzer medium containing appropriate amounts of EMS to determine whether subtilisin is excreted, or whether protease inhibitors inhibit the spor formation in bacteria. Following the activity determination results, subtilisin activity in EMS medium was found to be lower than that of control. Spore staining of the same samples and examination under microscope show that the spore formation occurs in EMS cultures, but not in controls. These results disagree with the opinions that the subtilisin is excreted during the sporulation and that protease inhibitors inhibit the sporulation.This effect of EMS might be due to an interaction with nucleic acids, and the future work should focus on this direction.