Dietilnitrozamin`nin sıçan karaciğer mikrozomal NADH-sitokrom b5 redüktaza invitro etkisi

Abstract

11 ÖZET Doktora Tezi DİETİLNİTROZAMİN'İN SIÇAN KARACİ?ER MİKROZOMAL NADH-SİTOKROM b5 REDÜKTAZ A İN VİTRO ETKİSİ FERDA CANDAN Cumhuriyet Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Kimya Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Atilla ATALAY Bu çalışmada, kanserojenik ve mutajenik bir bileşik olan Dietilnitrozamin'nin (DENA), saflaştırılan NADH-Sitokrom b$ redüktaz ve onun substratı Si- tokrom b$ üzerine etkisi in vitro olarak incelendi. Enzim ve sitokrom b$ sıçan karaciğer mikrozomlarından Sephadex G- 100 ve DEAE Selüloz kolon kromatografisi ile saflaştırıldı. Enzim aktivitesi, ferrisi- yanit ve sitokrom bs'in indirgenme hızı ile ölçüldü. Saflaştırma sonunda, enzim mikrozomlara oranla ortalama 300 kez saflaştırılıp, % 38 verimle elde edildi. Enzim aktivitesi ferrisiyanit ile ölçüldüğünde, enzimi % 50 inhibe eden DENA derişimi (I50), 6.6x1 0`4 M ; enzimin Km ve Vmax değerleri sırasıyla 0.221 mM ve 899.78 j.mol dk`1 mg protein `1 bulundu. Enzim aktivitesi sitokrom b$ ile ölçüldüğünde ise I50, Km ve Vmax değerleri sırasıyla 5.7x1 0`4 M, 426 nmol L_1 ve 262.57 nmol dk-1 mg protein `1 şeklinde bulundu. NADH-Sitokrom b5 redüktaz farklı DENA derişimleri ile inkübe edildiğin de Km değerlerinin sabit kaldığı, Vmax değerlerinin değiştiği bulundu. Dolayısı ile inhibisyonun nonkompetitif olduğu saptandı. Enzim substratı olan sitokrom bs, DENA ile inkübe edildiğinde ise DENA'nın indirgenmiş yapıdaki sitokrom bs'i yükseltgediği bulundu. Anahtar Kelimeler: Dietiinitrozamin, NADH-Sitokrom b$ Redüktaz, Sitokrom b$

m SUMMARY PhD Thesis IN VITRO EFFECTS OF DIETHYLNITROSAMINE ON THE RAT HEPATIC MICROSOMAL NADH-CYTOCHROME b5 REDUCTASE FERDA CANDAN Cumhuriyet University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Chemistry Supervisor: Prof.Dr. Atilla ATALAY In this study, in vitro effects of Diethylnitrosamine, a cancerogenic and mutagenic compound, on the purified NADH-cytochrome b$ reductase and its substrate of cytochrome b$, have been investigated. Enzyme and cytochrome b$ were purified from rat liver microsomes by using Sephadex G-1 00 and DEAE-cellulose column chromatographies. Enzyme activity was assayed by measuring the rate of reduction of cytochrome b$ and ferricyanide. At the end of the purification, NADH-cytochrome bs reductase was purified about 300 fold with a yield of 38 % with respect to microsomes. When the enzyme activity measured with ferricyanide, the D EN A con centration which inhibits enzyme activity of 50 % (I50) was 6.6x1 0`4 M ; The Km and Vmax values of enzyme were 0.221 mM and 899.78 u.mol dk`1 mg protein-1, respectively. Also, in measuring enzyme activity with cytochrome bs; ]jj0> Km and Vmax values were found as follows: 5.7x1 0`4 M, 426 nmol L~1 and 262.57 nmol dk_1 mg protein`1 ? respectively. When the enzyme was incubated with varying DENA concentrations, it was seen that Km values remained constant, whereas Vmax values varied. The refore, inhibition of the enzyme was found as noncompetitive. It was found also that reduced form of cytochrome b$, a substrate of the enzyme, has been oxidized when it was incubated with DENA. Key Words : Diethylnitrosamine, NADH-Cytochrome bs Reductase, Cytochrome bs.