Önemli zeytin (Olea europaea L.) çeşitlerinin izoenzim polimorfizmleri ve genetik özellikleri

Abstract

Bu tez çalışmasında, değişik izoenzim sistemleri kullanarak önemli zeytin çeşitlerinin genetiksel yapıları enzimler düzeyinde incelenmiş ve elde edilen polimorfizm değerlendirilmiştir. Çeşitler populasyonunun göstermiş olduğu izoenzim polimorfızlerinin değerlendirilmesiyle zeytin türünün yer aldığı Olea eıtropaea içindeki genetiksel yapı izoenzim düzeyinde belirlenmiştir. Çalışmada, fosfogluko izomeraz (PGI), alkol dehidrogenaz (ADH), malat dehidrogenaz (MDH), izositrat dehidrogenaz (IDH), fosfogluko mutaz (PGM) ve peroksidaz (PRX) izoenzim sistemleri kullanarak toplam 43 adet genotipten (29 adet çeşit, 5 Gemlik tipi, 3 Ayvalık tipi, 1 Memecik tipi ve 5 Ak delice) oluşan zeytin populasyonun da ayrıntılı analizler yapılmıştır. İncelenen izoenzim sistemlerine ait 7 lokusta toplam 23 adet allel belirlenmiştir. Elde edilen sonuçlar zeytin türü içinde yüksek düzeyde izoenzimatik varyasyon olduğunu göstermiştir. Allel sayısının yüksek olması zeytin türünün yüksek düzeyde heterozigotik yapıya sahip olduğunu göstermektedir. Çalışma sonucunda elde edilen genetik yakınlık verilere göre Manzanilla ve Eğriburun çeşitleri birbirine en uzak iki çeşit olarak saptanmıştır (9,76 Nei uzaklık değeri). Domat - Eğriburun, Domat - Lucques, Gordales - Domat, Karamürsel Su - Eğriburun ve Nizip Yağlık - Eğriburun çeşitleri de genetiksel yapılan birbirine uzak çeşitleri olarak değerlendirilmiştir. Genetik yakınlık bakımından bir değerlendirilme yapıldığında Tavşan Yüreği - Memecik 2,01 Nei uzaklık değeri ile birbirine en yakın çeşitler olarak saptanmıştır. Kiraz - Halhali, Samanlı - Domat ve Ayvalık - Çakır Yağlık çeşitleri de genetiksel yapılan birbirine benzeyen çeşitler olarak görülmüştür. Anahtar kelimeler : Olea europaea, Moleküler Marker, Polimorfizm

Genotypic structure of important olive cultivars was determined by using various isozyme systems and the polymorphism obtained was evaluated. Genotypic differences among population were detected by evaluation of profiles obtained from 6 different enzyme systems. In the study, malate deshydrogenase (MDH), alcohol deshydrogenase (ADH), isocitrate deshydrogenase (ICD), phosphogluco mutase (PGM), phosphogluco isomerase (PGI) ve peroxsidase (PER) were used as enzyme systems. Total loci, number of alleles and heterozygosity level were then determined in 43 olive genotypes (29 cultivars, 5 Gemlik types, 3 Ayvalık types, 1 Memecik type and 5 Ak delice). 23 alleles were determined in 7 loci belongs to the isozyme systems evaluated. According to the obtained data, a high level isozym variation was determined in investigated cultivars. The high numbers of alleles show that olive has high levels of heterozygotic genetic structure. The longest genetic distance was calculated between Manzanilla and Eğriburun cultivars according to the genetic data obtained (9.76 Nei). Domat - Eğriburun, Domat - Lucques, Gordales - Domat, Karamürsel Su - Eğriburun and Nizip Yağlık - Eğriburun cultivars evaluated as long genetic distances. In the consideration of short genetic distance, Tavşan Yüreği - Memecik cultivars were the closest cultivars with the value of 2.01 Nei. The cultivars Kiraz - Halhali, Samanlı - Domat and Ayvalık - Çakır Yağlık were also determined as close cultivars according to their genetical structure. Key Words : Olea europaea, Moleculer Markers, PolyformismSİMGELER VE KISALTMALAR ADH Alkol dehidrogenaz dH20 Bidistile su GOT Glutamat okzaloasetat transaminaz IDH Izositrat dehidrogenaz LAP Losin amino peptidaz MDH Malat dehidrogenaz MTT Malik enzimNAD Nicotinamid adenin dinükletid NADP Nicotinamid adenin dinükletid fosfat NBT Nitro Blue Tetrazolium PGI Fosfogluko izomeraz PGM Fosfogluko mutaz PMS Phenazine methosülfat PRX Peroksidaz PVPP Polivonil polipyrolidon RAPD Random amplified polymorphic DNA RFLP Restriction fragment lenght polymorphism IIIÇİZELGELER Çizelge Çizelge adı Sayfa No no Çizelge 1. Çalışmada Kullanılan Bazı Zeytin Çeşitlerinin Özellikleri18 Çizelge 2. îzoenzim polimorfızmleri incelenen zeytin çeşit ve tipleri20 Çizelge 3. Zeytinlerde genotipik tanılamada kullanılan izoenzim sistemleri23 Çizelge 4. İzoenzim sistemleri için kullanılan boyama solüsyonları27 Çizelge 5. Zeytin populasyonunda belirlenen ve farklı izoenzim istemlerine ait lokus ve allel sayılan32 IVŞEKİLLER Şekil No Şekil Adı Sayfa No Şekil 1. Ülkemizde zeytin yetiştiriciliği yapılan bölgeler ve zeytin ağacı yoğunluğu.2 Şekil 2. Olea europaea türü içinde görülen çeşitlilik3 Şekil 3. Memecik çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri21 Şekil 4. Ayvalık çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri21 Şekil 5. Gemlik çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri22 Şekil 6. Domat çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri22 Şekil 7. İzoenzim analizlerinin önemli aşamaları: 26 Şekil 8. Zeytinlerde değişik izoenzim sistemlerinden elde edilen polimorfizm örnekleri31 Şekil 9. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen PGI izoenzim model profili33 Şekil 10. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen ADH izoenzim model profili34 Şekil 1 1. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen MDH izoenzim model profili34 Şekil 12. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen IDH izoenzim model profili35 Şekil 13. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen PGM izoenzim model profili35 Şekil 14. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen PRX izoenzim model profili36 Şekil 15. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinden elde edilen PGI izoenzim sistemine ait profil modeli38 Şekil 16. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinden elde edilen ADH izoenzim sistemine ait profil modeli39 Şekil 17. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinden elde edilen IDH izoenzim sistemine ait profil modeli40ŞEKİLLER (devam) Şekil No Şekil Adı Sayfa No Şekil 18. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinden elde edilen MDH izoenzim sistemine ait profil modeli41 Şekil 19. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinden elde edilen PGM izoenzim sistemine ait profil modeli42 Şekil 20. Bazı zeytin çeşit ve tiplerinderrelde edilen PRX izoenzim sistemine ait profil modeli43 Şekil 21. İncelenen zeytin populasyonunda izoenzim allel kodlan ile oluşturulan dendrogram45 VIGİRİŞ Oleaceae familyasının bir üyesi olan zeytin (Olea europaea L.), Olea cinsi içindeki 20 tür arasında meyveleri tüketilebilen tek türdür. Zeytin, anavatanı olan Akdeniz havzasının doğu kısmından çıkmış ve Anadolu üzerinden Akdeniz'in Kuzey ve Güney sahilleri üzerindeki ülkelere doğru yayılmıştır. Zeytin ağacının daha sonra bu bölgelerden Amerika ve Avustralya kıtalarına götürüldüğü bilinmektedir. Dünyada zeytin alanları, 30-45. °C enlemler arasında yayılım göstermekte ve toplam 35 ülkede üretim yapılmaktadır. Ağaç varlığının %9 7' sinin Akdeniz havzasında yer aldığı görülmektedir. Yaklaşık 17.317.089 ton olan dünya tane zeytin üretiminin %77'si, Akdeniz havzasında bulunan 4 ülkede yoğunlaşmıştır. 2003 yılı dünya tane zeytin üretiminin %35'i İspanya'da, %18'i İtalya'da, %14.'ü Yunanistan'da gerçekleşmiştir. Türkiye %10.3 ile 4. sırada yer almaktadır (AkıIIıoğlu ve ark., 2000; FAO, 2003). Türkiye'de Ege, Marmara, Akdeniz, Güneydoğu Anadolu ve Karadeniz bölgelerinde, kuzeyde Artvin'den güneyde Hatay'a kadar uzanan kıyı boyunca ve Güneydoğu Anadolu7 da Mardin'e kadar uzanan geniş bir alanda zeytin yetiştiriciliği yapılmaktadır. Zeytin bu ekoloji içerisinde büyük bir çeşit zenginliğine sahiptir. Ülkemizde zeytin üretimi Ege ve Marmara bölgelerinde yoğunlaşmıştır (Şekil 1). 2003 yılı verilerine göre ülkemizin toplam zeytin üretimi 1.800.000 tondur (FAO, 2003). Ege bölgesi 992.068 ton ile birinci, Marmara bölgesi 499.115 ton ile ikinci sırada yer almaktadır. Bunun yanında Akdeniz (259.865 ton), Güneydoğu (41.612 ton), Karadeniz (3.220 ton) bölgeleri ise diğer zeytin üretilen bölgeler arasında yer almaktadır (DİE, 2000). Ege bölgesinde yağlık, Marmara bölgesinde ise sofralık üretim fazla yapılmaktadır. Mevcut zeytinliklerin %75'i besin maddeleri yönünden fakir, engebeli ve sulanmayan kıraç arazilerde %25'i ise düz veya hafif meyilli sulanabilen taban arazilerde yer almaktadır. Bu yapı yetiştirme tekniğini ve üretim maliyetlerini etkilemektedir (AkıIIıoğlu ve ark., 2000). Ülkemizin zeytin yetiştiriciliğinde önemli yer edinmesinde Anadolu'nun zeytinin gen kaynağım oluşturması ve çok uygun ekolojik özelliklere sahip olması büyük bir önem taşımaktadır. Ancak, zeytinciliğin Ülkemizde istenilen düzeyde olduğunu söylemek güçtür. Özellikle zeytin ıslahı, çeşit ve tiplerin genotipik tanılanması konusunda yapılan araştırmalar çok az sayıdadır.r ı «o Hi :0._ o ill l e & % T, 2 J (O LU O -I O£p Z> -1 O O < o o o > LU o o / < X o < < oşS8 - 5! 5: - / SU G*ğ [ZjNia loı as im « S» O > es 3 =3 )QJQ O o >ÖÛ CS c D N 1) > s-. 1j bû o J3 o 0) N (D N e 6 2 o1.1. Dünya'da ve Türkiye'de Zeytin Genetik Kaynaklan Zeytin, yaklaşık olarak 30 cins ve 600 tür ihtiva eden Oleaceae familyası içinde bulunmaktadır. Dünya'da 2000 'den fazla yetiştiriciliği yapılan zeytin çeşidinin olduğu tahmin edilmektedir. Zeytin, çeşit zenginliği en fazla olan türlerden biridir. İri meyveli, daha fazla yağ oranı içeren, hastalık, zararlılar ve abiyotik çevre koşullarına daha dayanıklı ve verimli çeşitler gelişirken, üstün özelliklere sahip bazı çeşitlerin kaybolduğu görülmektedir. Bir çok çeşit eski zamanlarda tanımlanmış olmasına rağmen, hala sınıflandırılması tam olarak yapılmamış, bir çok çeşit ise yöresel olarak isimlendirilerek karmaşık bir durumun ortaya çıkmasına neden olunmuştur. 1970 'ten beri Yunanistan, İspanya ve Fransa'da yapılan bazı genetik araştırmalar dışmda çeşitlerin tam olarak smıflandınlmasım sağlayacak araştırma yapılmamıştır (Blasquez, 1999). Genetik olarak çeşitleri ayırt etmek için kullanılan analitik tekniklerin uygulanmasındaki güçlükler nedeniyle, değişik çeşitlerin morfolojik, biyolojik ve agronomik özellikleri tam olarak değerlendirilmemiştir. Şekil 2. de Olea europaea türü içinde yer alan çeşitlerin göstermiş olduğu varyasyon örnek olarak verilmiştir. Şekil 2. Olea europaea türü içinde görülen çeşitlilikDünya da bazı önemli zeytin yetiştiren ülkeler, meyvelerin kullanım amaçlarına göre düzenlenerek aşağıda verilmiştir. İspanya : Alameno de Cabra, Alorena, Arbequina, Avellanejo, Blanquillo, Carrasqueno de Alcaudete, Carrasquillo, Chorreao de Montefrıo, Datilero, Lechın de Sevilla, Manzanilla de Huelva, Manzanilla Picua, Morcal, Negrillo de Arjona, Negrillo de Estepa, Negrillo de Iznalloz. Negro, Nevadillo, Picual de Almerıa, Rechino, Torcio, Verdial de Velez-Malaga. Zorzariega (Yağlık çeşitler); Buidiego, Campanil, Canivano Negro, Cornezuelo, De Sal, Dulzal, Gordal, Gordal de Archidona, Gordalejo, Imperial, Limoncillo, Loaime, Manzanilla, Manzanilla de Almerıa, Manzanilla de Agua, Manzanilla de Montefrıo, Manzanilla de Piquito, Manzanilla de Jaen, Manzanilla- Cacerena Morona, Picudö, Tomadillo (Sofralık çeşitler); Bical, Carrasqueno de la Sierra, Changlot Real, Galego, Gatuno, Hendeno, Hojiblanca, Lechin de Granada, Manzanilla Prieta, Manzanilla de Zahara, Mollar, Ocal, Pico Limon, Rapasayo, Royal, Verdial de Huevar (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). İtalya : Barese, Biancolilla, Bosana, Canino, Carpellese, Casaliva, Castiglionese, Cellina di Nardo, Cerasuola, Corregiolo, Dritta, Frantoio, Gargna, Gentile di Chieti, Gentile di Larino, Leccino, Maurino, Messinese, Moraiolo, Ogliarola di Lecce, Olivella, Ottobratica, Pendolino, Pisciottana, Procanica. Ravece, Raja. Razzola, Rotonda, Rotondello, Rosciola di Rotelle, Satnagatese, Sargano, Sinopolese, Taggiasca (Yağlık çeşitler); Ascolana Tenera, Bela di Cerignola, Bela di Spagna, caizzana, Giarraffa, Nocellara del Belice, Nocellara Etnea, Pizz'e Carroga, Santa Caterina, Sant'Agostino, Tonda Iblea, Uovo di Piccione, Zaituna (Sofralık çeşitler); Ascolana Semitenera, Carolea, Cucco, Grosa di Cassano, Intosso, Itrana, Maiatica di Ferrandina, Messinese, Moresca, Nera di Gonnos, Nocellara, Passalunara, Provenzale, Tonda di Cagliari (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). Portekiz : Alentejana, Cobrancosa, Madural, Mora, Verdeal Picual, Verdeal Transmontana (Yağlık çeşitler); Azeitoneira, Gordal, Hojiblanca, Negrinha (Sofralık çeşitler); Algarvia, Bical de Castelo Branco, Blanquita, Conerva de Elvas, Cordovil de Castelo Branco. Cordovil de Serpa, Galega Grada de Serpa, Galega Vulgar, Macanilha, Macanilha Carrasquenha, Macanilha Carrasquenha de Almendralejo, Redondal, Redondil, Verdeal Amentejana (Hem sofralık hem yağlık çeşitler).Fransa : Araban. Argental, Blancal, Bouteülan, Cailletier, Moiral, Oliviere, Pendoulier, Pigalle, Pignole, Rendonan, Ribier, Rouget, Sayem (Yağlık çeşitler); Lucques (Sofralık çeşitler); Aglandau, Amellau, Argoudeil, Belgentieroise, Bouteülan, Cailletier, Germaine, Grossanne, Pagetoise, Picholine, Poumal, Pruneau de Cotignac, Solonenque, Tanche, Verdale (Hem sofralık hem yağlık çeşitler). Yunanistan : Agouromanacolia, Corfolia, Koroneiki Daphnoella, Daphonolia, Mastoidis Grande, Mastoidis Micra, smertolia, Throumbolia, Vanalolia (Yağlık çeşitler); Adrocarpos, Amygdaloila, Konservolea, Halkidiki, Mastoides, Stravolia (Sofralık çeşitler); Adramittini, Carydolia, Kalamata, Methonia, Megaritiki, Vassiliki (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). ABD (Kaliforniya) ve Meksika : Ascolana Tenera, Sevillana (Sofralık çeşitler); Manzanilla, Mission (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). İsrail : Barnea (Yağlık çeşitler); Kadesh, Manzanilla, Mehravia, Uovo di Piccione (Sofralık çeşitler); Muhasan, Nabali Baladi, Souri (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). Fas : Meslala (Sofralık çeşitler); Haouzia, Manzanilla, Picholine Marocaine (Hem yağlık hem sofralık çeşitler). Suriye : Zaity (Yağlık çeşitler); Abou-Salt, Djlat, Kaiss (Sofralık çeşitler); Dan, Doebli, Khodeiri, Soudeiry, Sorani (Hem sofralık hem yağlık çeşitler). Türkiye : Zeytinin anavatanı olan ülkemizde büyük bir çeşit zenginliği bulunmaktadır. Aşağıda bölgelerimize göre yetiştiriciliği yapılan önemli çeşitler verilmiştir (Canözer, 1991). Ege bölgesi Türkiye'nin en önemli zeytinci bölgesi olup toplam ağaç varlığının %68'ine sahip bulunmakta ve üretimin %75'ini sağlamaktadır. Ürünün %86'sı yağlık, %14'ü sofralık olarak değerlendirilmektedir. Bölgede Ayvalık, Çakır, Çekişte, Çilli, Domat, Erkence, îzmir Sofralık, Kiraz, Memecik, Memeli ve Uslu önemli zeytin çeşitleridir. Ayrıca Ak Zeytin, Aşı Yeli, Dilmit, Eşek Zeytini, Girit Zeytini, Hurma Kaba, Hurma Karaca, Kara Yaprak, Taşarası, Yağ Zeytini ve Yerli Yağlık çeşitleri de bölgede yetiştirilmektedir. Marmara Bölgesi, Türkiye'nin toplam ağaç varlığının %15'ine ve üretimin %12'sine sahiptir. Ürünün %84'ü sofralık olarak değerlendirilmekte, ancak kalite dışıürün yağa işlenmektedir. Bölgenin en önemli çeşidi siyah sofralık olarak değerlendirilen Gemlik çeşidi olup, bölge ağaç varlığının yaklaşık %80'ini bu çeşit teşkil etmektedir. Diğer önemli çeşitler; Çelebi, Edincik Su, Karamürsel Su ve Samanlı'dır. Ayrıca, Beyaz Yağlık, Çizmelik, Erdek Yağlık, Eşek Zeytini, Şam, Siyah Salamuralık çeşitleri de yetiştirilmektedir. Akdeniz bölgesi, Türkiye toplam ağaç varlığının % 11 'ine ve üretimin %1 l'ine sahiptir. Ürünün %68'i yağlık, %32'si sofralık olarak değerlendirilmektedir. Bölgenin önemli çeşitleri; Büyük Topak Ulak, Halhali, San Hasebi, Sarı Ulak, Saurani, Karamani, Küçük Topak Ulak ve Sayfi gibi yöresel çeşitlerdir. Güneydoğu Anadolu bölgesinde zeytincilik Akdeniz ikliminin etkisi altında kalan alanlarda yapılmaktadır. Bölge, toplam ağaç varlığının %5'ine sahip olup üretimin %2'sini sağlamaktadır. Ürünün %73'ü yağlık, %27'si sofralık olarak değerlendirilmektedir. Eğriburun, Kalembezi, Kan Çelebi, Kilis Yağlık, Nizip Yağlık ve Yağ Çelebi. bölgenin önemli çeşitlerindedir. Ayrıca; Belluti, Halhali Çelebi, Hazma Çelebi, Hursuki, İri Yuvarlak, Mavi, Yağlık Çelebi, Yün Çelebi gibi çeşitlerde yetiştirilmektedir. Karadeniz bölgesinde ise zeytin, soğuk kuzey rüzgarlarından korunaklı mikroklima özelliği gösteren bölgelerde yetiştirilmektedir. Ağaç varlığının %0.6'sma sahip olup üretimin %0.5'ini sağlayan bu bölgede Butko, Görvele, Marantelli, Pastos, Otur, Salamuralık, Tuzlamalık, Yağlık adı altında yöresel çeşitler yetiştirilmektedir. Yağlık veya sofralık olarak değerlendirilen bu çeşitler dışında yabancı çeşitlerinde yetiştiriciliği yayılmaktadır. Manzanilla, Ascolana, Hojiblanca ve Lucques önerilen yabancı kökenli çeşitlerdir. Ülkemizin zeytin gen kaynaklarını oluşturan çeşit sayısını belirlemek amacıyla tüm zeytinci bölgelerde yapılan sörveyler sonucunda tespit edilen 88 zeytin çeşidinden 1968 yılında alman aşı kalemleri çöğürlere aşılanarak `Yerli Zeytin Çeşitleri Koleksiyon Bahçesi`, 1970-1971 yıllarında İspanya, İtalya, Fransa, Tunus ve Suriye'nin önemli zeytin çeşitlerinden oluşan 28 çeşitten aşı kalemlerinin ithal edilerek çöğürlere aşılanmasıyla `Yabancı Zeytin Çeşitleri Koleksiyon Bahçesi` Zeytincilik Araştırma Enstitüsü'nün Kemalpaşa' daki Araştırma ve Üretim Sahasında tesis edilmiştir. Enstitüdeki yerli ve yabancı koleksiyon bahçeleri ile ulusal ve uluslararası düzeyde `Zeytin Gen Bankası` nın oluşumu gerçekleştirilmiştir. Gen bankasındaki çeşitzenginliği ve varyasyonlardan yararlanılarak yapılacak ıslah veya benzeri çalışmalarla, Türkiye'de zeytin verimliliğinin ve kalitenin arttırılması çabaları sürdürülmeye çalışılmaktadır (Akıllıoğlu ve ark., 2000). 1.2. Genotipik Tanılamada Kullanılan Moleküler Markör Teknikleri ve İzoenzim Analizlerinin Kullanım Alanları Özellikle son 20 yıl içerisinde genetik kaynakların tanılamasında biyokimyasal ve moleküler markörler daha sık kullanılmaya başlamıştır. Yapılan çalışmalarla protein düzeyinde filogenetik çalışmalar yapabilecek düzeyde gen loküsleri belirlenmiş ancak, bu lokuslann da yeterli olmadığı görülmüştür. Özellikle tür içi varyasyonların saptanmasında sınırlı kullanım alam olan izoenzim analizleri doğrudan DNA analizinde kullanılan RFLP ve PCR tabanlı tekniklerinde belli düzeyde temelini oluşturmuştur. Gelecekte kuşkusuz doğrudan DNA analizi genetik kaynak merkezlerinde çok daha yoğun kullanım alam bulacaktır. Ancak bu tekniklerin çok pahalı olması en büyük engel olarak karşımıza çıkmaktadır. İzoenzim terimi ilk defa Markert ve Moller (1959) tarafından benzer katalitik özelliklere sahip enzimlerin çoklu moleküler formları için kullanılmıştır. İzoenzimler, modern enzim sınıflandırma sisteminde 6 grup içerisinde yer almaktadırlar. Bu gruplar: Oksidoredüktazlar, Transferazlar, Hidrolazlar, Liyazlar, İzomerazlar ve Sentetazlardır. Bazı grupların canlı biyokimyasmdaki görevleri kısaca aşağıda belirtilmiştir: Oksidasyon ve redüksiyon reaksiyonlarını katalizleyen enzimler OKSİDOREDÜKTAZLAR olup, DEHİDROGENAZLAR bu grupta yer alırlar. Transferazlar fonksiyonel bir grubu bir donörden bir akseptöre taşırlar ve AMINOTRANSFERAZLAR bu grupta yer alırlar. İZOMERAZLAR bir molekül içindeki geometrik ve yapısal değişiklikleri katalize etmektedirler (Gözükara, 1997). İzoenzimler kromotografi, jel filtrasyonu, sedimentasyon, elektroforez ve serolojik metodlar gibi birçok biyokimyasal teknik kullanılarak aynştırılabilmektedirler. Bunların içerisinde jel elektroforezi, kullanım alam en geniş olan tekniktir ve bu kompleks moleküllerin elektroforetik olarak ayrılması nişasta, poliakrilamid, agaroz jel ve selüloz asetat gibi ortamlar içinde yapılabilmektedir. Ancak, agaroz jel ve selüloz asetat izoenzim analizleri için genellikle tercih edilmemektedir. Poliakrilamid j eller genellikle görüntü çözünürlüğünün yüksek olması nedeniyle birçok enzim sistemi içintercih edilmektedir. Fakat, nişasta jelleri ise yine birçok enzim sisteminde başarılı sonuçlar ortaya koyması nedeniyle poliakrilamid jellere oranla daha sık kullanılmaktadır. Bunun nedeni nişasta jellerinin oransal olarak daha ucuz ve daha kolay hazırlanması ve toksik yapıda olmamasıdır. Ancak ribonükleaz, piruvat dekarboksilaz ve amilaz gibi enzimlerin nişasta jeli üzerinde gözlemlenmesi mümkün olmadığı için poliakrilamid jel kullanımı zorunluluk taşımaktadır. Nişasta jellerinin önemli bir üstünlüğü ise jelin yatay olarak 1 mm kalınlığında kesilerek farklı enzimler için aynı zamanda çalışmasına olanak tanımasıdır. Elektroforez uygulamaları enzim polimoffizmini ayrıntılf bir şekilde ortaya koyması bakımından büyük olanaklar taşımaktadır (Shaw ve Prasad, 1970; Marshall ve Brown, 1975; Glaszmann ve ark.,1988). Elektroforez, temel olarak makromoleküllerin bir elektriksel alan içinde bu güç tarafından ayrılmasıdır. Bunlar, farklı moleküler ağırlık ve elektriksel yüklere sahiptir. Bununla birlikte elektroforetik hareketlilikleri farklı pH koşullarında yine değişken özellikler göstermektedir. Özellikle yapılan ıslah çalışmalarında elde edilebilen melezlerin genetik yapısının yani hibriditenin çok erken dönemlerde belirlenebilmesi izoenzim analizleri ile mümkün olabilmektedir. Bunun yanında izoenzim analizleri zeytinde heterozigoti düzeyinin belirlenmesi, zigotik kökenli bireylerin birbirlerinden ayrılabilmesi, tür ve çeşitlerin birbirleri ile olan genetiksel ilişldlerinin ortaya çıkarılabilmesi amaçlarıyla da yoğun olarak kullanılmaktadır. TÜBİTAK tarafından desteklenen bu çalışmada, değişik izoenzim sistemleri kullanarak önemli zeytin çeşitlerinin genetiksel yapılan enzimler düzeyinde incelenmiş ve elde edilen polimorfizm değerlendirilmiştir. Çeşit populasyonunun göstermiş olduğu izoenzim polimorfizlerinin değerlendirilmesiyle zeytin türlerinin yer aldığı Olea cinsi içindeki genetiksel yapı izoenzim düzeyinde belirlenmiştir.2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Torres ve ark. (1978), elektroforez teknikleri ile izoenzim profillerinin ortaya çıkarılmasının moleküler markör olarak kullanışlı bir teknik olduğunu bildirmektedir. İzoenzimlerin diğer moleküler markör tekniklerine olan önemli bir üstünlüğü ise, bunların doğrudan gen ürünleri olması ve karışık bir seri biosentez reaksiyonları ürünleri olmasıdır. Glaszmann ve ark. (1988), polimorfizmin saptanması ve izoenzimleri kodlayan genlerin kromozom üzerinde ki yerlerinin bilinmesinin, bu özelliklerin genetik markör olarak kullanılmasına olanak tanıdığını bildirmektedir. Bu genlerin sağladığı bir çok avantaj söz konusudur. Örneğin bu özellikler farklı çevre koşullarından etkilenmezler, epistatik ilişkileri bulunmaz ve gerçek genotipi belirleyen kodominansi özelliğine sahiptirler. Çok genç dokuların kullanılabilmesi onların enzimatik profilinin ortaya çıkarılmasını sağlar. OUitrault (1990), izoenzim analizleri ve RFLP genetik moleküler markörlerinin ıslah ve taksonimi çalışmaları için güvenilir kaynaklar olduğunu bildirmiştir. İzoenzimler in vitro kültürlerin taranmasında, zigotik ve miseller orijinli bitkilerin ayırt edilmesinde, çeşit tanımlanması, heterozigoti ve fılogenetik ilişkilerin ortaya çıkarılmasında çok kullanılışlı bir tekniktir. Araştırıcı günümüzde üç tip moleküler markörün yoğun olarak kullanıldığım belirtmektedir. Bunlar : a) Kromotografi teknikleri ile polifenol ve esansiyel yağlar gibi sekonder metobolitlerin analizlenmesi, b) Elektoroforez teknikleri ile toplam protein ya da izoenzimlerin analizleri ve c) RFLP ile DNA'nin analizinin yapılmasıdır. Sekonder metobolitlerin analizi direkt genetiksel moleküler markör olmadıkları için ve çoğunlukla çevre koşullarından etkilendikleri için çok kullanışlı değildirler. İzoenzimler elektroforez yoluyla nişasta veya poliakrilamid jel üzerinde elektriksel yükleri ve moleküler ağırlıklarına göre ayrılabilirler. Poliakrilamid nişastaya oranla daha yüksek çözünürlükte profillerin elde edilmesini sağlarlar ancak teknik olarak daha zor ve pahalıdır. Enzimatik sistemlerin çevrilmesi hangi organ kullanılıyor olursa olsun ve bitkinin yaşı ve fizyolojik koşullar ne olursa olsun son derece stabildir. Ancak bu kural esteraz, asit fosfotaz ve peroksidaz gibi fizyolojik faktörler tarafından da kontrol edilenenzimler için geçerli değildir. Bu nedenle, bu enzimlerin genetik markör olarak kullanılması pek mümkün görülmemektedir. İzoenzimler ve RFLP, türler içi yapının çıkarılmasında ve taksonlar arasında ki fılogenetik ilişkilerin yorumlanmasında en kullanışlı tekniklerdir. Moleküler markörlerin çeşit tanılamadaki etkinlikleri türlerin polimorfızmi ile ilgilidir. Her bir çeşit fizyolojik ve morfolojik karakterler bakımından farklılıklar taşımaktadır. Ancak, eğer bu karakterler üzerinde basit bir mutasyon meydana gelmişse izoenzimler ya da RFLP bu konuda yeterli olmamaktadır. Eğer melezleme söz konusu isergenom tamamen değiştiği için bunun görülmesi daha kolay olabilmektedir. Enzimatik polimorfizm türler arasında büyük farklılıklar taşıyabilmektedir. Santi ve Lemoine (1990), fenolik bileşiklerin kiraz ıslah programlarında çok faydalı bir genetik markör olarak kullanıldıklarını, ancak bu bileşiklerin çevre koşullarından çok fazla etkilendiklerini ve kalıtımlarının son derece karmaşık olması nedeniyle kulanım alanının sınırlı olduğunu bildirmektedir. İzoenzim sistemlerini ise fenolik bileşiklere oranla çok daha kullanışlı ve sonuçlarının daha duyarlı olduğunu bildirmiştir. Omura (1991), genetik varyasyonun değerlendirilmesiyle ıslahta ve genetik kaynakların korunmasında gereksinim duyulan temel bilginin sağlanabileceğini ve germplazlarda çeşitliliğin karakterize edilebilmesi için izoenzim analizlerinden yararlanabileceğini açıklamıştır. Moore ve Durham (1992), izoenzim analizlerinin en çok kullanılan moleküler markör teknikleri olduğunu bildirmektedir. Birçok enzim polimorfızmi basit bir genetik temele sahiptir. Tek bir lokusta allellik polimorfızmi gösteren izoenzim bantları (alloenzimler) kodominant etki gösterirler ve heterozigoti gösterenler ile homozigoti gösterenler birbirlerinden ayrılabilirler. Heterozigot bitkiler bir monomerik enzim lokusu için iki adet alloenzim bantı oluştururlar, dimerik enzim durumunda ise üç bant oluşacaktır, çünkü dimerik lokusta allel ürünler tesadüfi olarak birleşirler ve hem homodimer hem de heterodimer oluştururlar. En faydalı izoenzim loküsü allel sayısı belli olandır. Pratikte izoenzim bantları ile yapılan çalışmalar bunların in vivo koşullardaki önemleri dikkate alınmaksızın gerçekleştirilir. Yani izoenzim polimorfızmi ile önemli tarımsal özellikler arasında ilişki kurulamaz. Ancak, izoenzim polimorfîzmleri fenotipik olarak nötrdürler ve lokuslar arasında epistatik ya da pleiotropik etkileşimler nadiren oluşur. Bazı enzimler farklı dokularda ve farklı çevre 10koşullarında her zaman stabil bant oluşturmadıkları için bunlar moleküler markörler olarak kullanılmazlar. Yazar yaptığı derlemesinde, çok yıllık türlerde izoenzim analizleri ile elde edilen bazı sonuçları da vermiştir. Germplazmalarda korunan bitkisel materyalde izoenzim polimorfızminin belirlenmesi genotiplerin durumu ve germplazmdaki genetik çeşitlilik üzerine önemli olabilir. Bir cins üzerinde yapılacak izoenzim çalışmaları o cins içerisinde bulunan potansiyel markör geninin ortaya çıkarılmasını kolaylaştırabilmektedir. İzoenzimler meyve fidanlıklarında çoğaltılan bitkilerin genetiksel durumu ile ilgili ayrıntılı sonuçlar verebilmektedir. Hem çöğür populasyonlann da hem de kullanılan çeşitlere ait damızlık bitkilerin kontrol edilmesi, bir örnek fidan elde etmek açısından önem taşımaktadır. İzoenzim polimorfizminin çeşit tanımlanmasında sunduğu olanaklar sınırlıdır. İzoenzimlerde yeterince polimorfizmin bulunmaması bunun en önemli nedenidir. Kullanılan polirriorfizm sayısı arttıkça çeşitlerin tanımlanması daha kolay olabilmektedir. Üzüm çeşitlerinde yapılan çalışmalar bunun en iyi örneklerini gösterebilmektedir. Çiçek tozu izoenzimleri kullanılarak 37 üzüm çeşidi birbirlerinden ayrılabilmişlerdir. Bir diğer çalışmada ise 3 farklı lokus dikkate alınarak 27 üzüm çeşidinin % 93 'ü tammlanabilmiştir. Ancak 2 lokus incelendiğinde 145 üzüm çeşidi değişik gruplara ayrılmışlar ancak % 17' si diğerlerinden farklı genotipik özellikler taşıdıkları belirlenmiştir. Elmalarda yapılan diğer bir çalışmada ise sadece peroksidaz izoenzimi dikkate alındığında 108 elma çeşidinin 26 fenotipik gruba ayrıldıkları saptanmıştır. Buna karşın elmalarda yapılmış diğer bir çalışmada ise 6 izoenzimatik lokus üzerinde çalışılmış ve 54 elma çeşidi birbirlerinden ayrılabilmişlerdir. Şeftalilerde yapılan bir çalışma da ise 14 izoenzim sisteminden sadece 4'ü çeşitlerin tammlanabilmesini sağlamıştır. Kayısılarda ise çeşitlerin ayrılabilmesi daha zor görünmektedir. Kontrol edilen 69 kayısı çeşidinin sadece 7 tanesi izoenzim polimorfizmleri ile tammlanabilmişlerdir. Eriklerde ise yine benzer bir durumla karşılaşılmıştır. Çok yıllık meyve türlerinde bir çok değerli çeşit göz mutasyonu ile oluşmuştur, îzoenzimlerin kullanılarak bu tür mutant tiplerin belirlenebilmesi de kısıtlıdır. Leconte ve ark. (1994), kauçuk yetiştiriciliğinde aşı gözü kaynağı olarak kullanılan bitkilerin ismine doğru özellik taşımaları gerektiğini bildirmektedirler. Tip 11dışı olabilecek bitkiler başta hastalıklara duyarlılık olmak üzere bir çok istenmeyen özellik taşıyabilmektedirler. Tip dışı bitkiler 20 kadar yaprak özelliği kullanılarak fenotipik anlamda birbirlerinden ayrılabilmektedirler. Ancak bu özelliklerin kullanılması her zaman doğru sonuçları göstermeyebilmektedir. Bu nedenle genetik moleküler markörler gibi tekniklerin kullanılması gerekmektedir. Bu teknikler başta güvenirlik olmak üzere kolay olması, oransal olarak ucuz olması ve bitki populasyonlarına kolaylıkla uygulanabilir olması gerekmektedir. Izoenzim analizleri tüm bu özellikleri taşımasından dolayı tercih edilen bir teknik olmuştur. Bu amaçla araştırıcılar, arazi koşullarında basit bir altyapı çerçevesinde portatif bir elektroforez laboratuarı geliştirilmiştir. Weeden (1996), izoenzim analizlerinin kullanım alanlarını aşağıda belirtmiştir: a) Germplazmlardaki genetik çeşitliliğin belirlenmesi Islahçılar için germplazmlar önemli karakterlerin elde edilmesi bakımından büyük bir önem taşırlar, ancak farklı genotiplerin özelliklerin belirlenmesi ve istenilen karakterlerin bulunması uzun zaman alabilir. Germplazmlarda ki seleksiyonlar genellikle morfolojik ve fizyolojik karakterler kullanılarak yapılmakta ve bu amaçla deskriptörlerden de yararlanılmaktadır. İzoenzim polimorfizmi de germplazmlardaki seleksiyonlarda yararlı bir araç olarak kullanılabilmektedir. Yazarlar germplazmlarda izoenzim profillerinin belirlenmesi, 1) Populasyon veya çeşitlerin tanılanması, 2) Genotipler arasındaki genetik farklılıkların belirlenmesi, 3) Türler arasında ki genetiksel ilişkilerin saptanması, 4) Yinelemeler arası olabilecek farklılıkların belirlenmesi, 5) Germplazm çalışmalarında planlamaların yapılması gibi konularda büyük önem taşıdığım bildirmişlerdir. b) Çeşitlerin ve farklı melez yapıların tanılanması Çeşitler arasındaki genetiksel farklılıkların bir sonucu olarak izoenzim profillerinde de farklılıklar ortaya çıkmaktadır ve bu kural genel olarak tüm bitki türleri için geçerlidir. Ancak domates, biber, bezelye ve hıyar gibi sebzelerde görülen düşük izoenzim varyasyonu bunların kullanımım sınırlandırmaktadır. c) Melezlerin tanılanması îzoenzimatik varyasyonların sıklıkla kullanım alam bulduğu alanlardan birisi de farklı genomların birleştirildiği melezleme çalışmalarıdır. Bunların içerisinde protoplast füzyonu ve embriyo kurtarma tekniği gibi modern çalışmalarda da izoenzim analizleri ıslatıcılara büyük kolaylıklar sağlayabilmektedir. Bu yönüyle izoenzimler 12DNA kullanılmaksızın melez yapısının net bir şekilde saptanabildiği tek analiz sistemidir. DNA analizlerinin daha karmaşık, teknik olarak çok daha pahalı olması nedeniyle izoenzim analizlerinin üstünlüğü rahatlıkla belirtilebilir. d) Aneuploid ve Triploidlerin Belirlenmesi Kromozom sayısında ki artış yada azalmalarla ilgili olarak gerçekleşen genetik değişimler genetik değişimler izoenzim desenlerinde de değişikliklere neden olmaktadır. Bununla birlikte kromozom üzerinde oluşabilen translokasyon gibi değişiklikler de izoenzim desenlerini değiştirebilir. Bu durumda zimmogram üzerinde ki -bazı bantların yoğunluğunda artış ya da azalış görülebileceği gibi yeni bantların eklenmesi durumu da söz konusu olabilir. e) Somaklonal Varyasyonların Belirlenmesi Doku kültürü uygulamalarında meydana gelen genetiksel değişimler çoğunlukla ploidi değişimleri şeklinde gerçekleşmektedir. Bu durumda yine zimmogramlar üzerinde bant kaybı ya da yeni bant oluşumu gerçekleşebilir. Lavee ve ark. (1997), PCR-RAPD parmak izi metodunu kullanarak Doğu Akdeniz'de Nabali Baladi çeşidinde genetik çeşitliliğini inceleyip doğruluğunu saptamak amacıyla İsrail'de araştırma yapmışlardır. Nabali grubundan 8 tipden ön seçimle yaprak örnekleri alınmış ve DNA' lan elde edilmiştir. Nabali içinde DNA farklılığı 8 klonda görülmüştür. Küme analizleri ile farklı klonlar arasındaki akrabalığı tespit etmişlerdir. Seçilen 8 tipte, farklı genetik yapılarında yüksek benzerlik bulunmuştur. Seleksiyonun başlamasıyla; uniform bir bahçe kurmak, yeni ve daha verimli çeşit elde etmek, gelecek için klonlann kimliklerin saptanması ve ümitvar çeşitlerin seçilmesinin umut verici olduğunu bildirmişlerdir. Sedgley (1998), yaptığı çalışmada Avustralya'da yetişen yabani zeytin çeşitlerin seleksiyonu, adaptasyonu ve erken tanımlama için DNA analizi ile genetik parmak izlerini araştırmıştır. Careggiolo ve Frantoio çeşitlerinin farklı olduğu düşünülürken parmak izleriyle benzer çeşit olduğunu saptamıştır. Ayrıca Nevadillo Blanco ve Picual çeşitlerinin de benzer çeşitler olduğunu saptamıştır. Kaliforniya (ABD), İsrail ve Avustralya'dan alman Manzanilla ile yapılan çalışmada profillerin çok benzer olduğunu saptamıştır. Kalamata'nm değişkenliğinin orta derecede olduğunu belirtmiştir. Vergari ve ark., (1998), zeytin çeşitleri geleneksel olarak morfolojik karakterlerine göre tanımlanmaktadır. Zeytin çeşitlerinin morfolojik özelliklerine göre 13yapılan çeşit belirleme yöntemi bazı çeşitlerin benzerliklerinden dolayı yanlış olarak adlandırılmasına veya zeytin çeşidinin kesin olarak belirlenememesine ve bazı karışıklıklara yol açmaktadır. Bu morfolojik özellikler çevre faktörleri ve yetiştirme tekniklerine göre değişim gösterdiğini bildirmişlerdir. Wiesman ve ark. (1998), yaptıkları çalışmada İsrail ve doğu kesimlerindeki yetiştiriciliği yapılan zeytin çeşitlerini tanımlamak amacıyla RAPD analizi yapmışlardır. Elde edilen sonuçlar, Nabali çeşidinin çoğunlukla kendi çiçek tozları ile tozlanmasına ve uyuşmazlık sorunu olmamasına rağmen genetiksel açılım meydana geldiğini göstermiştir. İsrail'in kuzey bölgelerinden seçilen çeşitler- (Manzanilia-IT, Souri, Barnea, 80-B-69, Muhasan ve Maalot) incelenmiş ve genetiksel bakımdan benzer yönlerinin olduğunu saptamışlardır. Bu çeşitlerin bazı klonlannın çevre faktörlerinin etkisiyle farklılaştığım da bildirmişlerdir. Çalıştıkları bölgedeki zeytin ağaçlarının kimlikleri hakkında belirsizlikler olduğunu belirten Wiesman ve ark. (1998), yerel olarak farklı biçimde adlandırılan zeytin çeşitlerinin genetik olarak benzer olabileceğinden söz etmektedir. Mekuria ve ark. (1999), Avustralya da ve Akdeniz havzasında bazı ülkelerde (İtalya, İspanya, Amerika, İsrail, Yunanistan ve Türkiye) yabani zeytin çeşitlerin genetik kimliklerini saptamak amacıyla bir çalışma yapmışlardır. Yabani zeytin çeşitlerinden alman yaprak örneklerinden DNA parmak izlerini çıkartarak veri tabanlarını oluşturmuşlardır. Bu veri tabanları ticari ve yabani çeşitlerin arasındaki genetik farklılık seviyesi belirlenmiştir. Genetik benzerlikleri gösteren dendrogramlar Basit Benzer Katsayılar, UPGMA ve Sayısal Taksonomi Sistemi kullanarak oluşturmuşlardır. Manzanilla ve Kalamata çeşitlerinin genetik benzerliğinin yüksek seviyede olduğu görülmüştür. Şeker (1999), Çukurova Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bahçe Bitkileri Bölümüne ait `Tuzcu Turunçgiller Kolleksiyonu` içerisinde yer alan toplam 856 adet turunçgil ve akrabalarına ait cins, tür, çeşit, klon ve tiplerinin genom büyüklükleri ve izoenzim profilleri kullanılarak genetiksel yapılarını incelemiştir. Çeşitli ülkelerden yapılan introdüksiyonlarla birlikte, Ülkemizde yürütülmüş ıslah çalışmaları ile elde edilen portakal, mandarin, limon, altıntop, turunç, kaba limon, laym, ağaç kavunu, şadok, bergamot, değişik turunçgil türleri, üç yapraklı, sitranj, sitrumelo, sitremon, kamkat ve akraba türlere ait genotiplerde 8 farklı sisteme ait izoenzim analizleri Malat dehidrogenaz (MDH), Alkol dehidrogenaz (ADH), İzositrat 14dehidrogenaz (İCD), Fosfogluko mutaz (PGM), Fosfogluko izomeraz (PGI), Endopeptidaz (End), Lösin amino peptidaz (LAP) ve Glutamin amino transferaz (GOT) ile yine bu materyallerde ploidi düzeyleri ile genom hacimlerinin belirlenmesi amacıyla `Flow Cytometry` analizini kullanmıştır. Sonuç olarak tüm genotipler topluca değerlendirildiğinde kullanılan izoenzim sistemleri bakımından toplam 32 adet allelin oluşturduğu polimorfızmi belirlemiştir. Ancak, portakallarda olduğu gibi bazı genotiplerde tür içi ve çeşit içi izoenzimatik polimorfizm saptanamamıştır. Çalışma süresince yapılan Flow Cytometry analizleri ile incelenen genotiplerin çoğunlukla diploid oldukları ancak 9 adet tetraploid ve 5 adet triploid olmak üzere poliploid genotipinde olduğu saptanmıştır. Citrus cinsi içindeki diploid genotipler arasında genom hacmi bakımından ağaç kavununun {Citrus medico) en büyük genoma sahip olduğu belirlenmiştir. Besnard ve ark. (2001), Akdeniz havzasında yeni çeşitlerin oluşumunda yabani ve kültüre alınmış çeşitlerin melezlenmesinin en önemli etken olduğunu belirtmiştir. İzoenzimlerle yapılan bir çalışmada çeşitler ve deliceler arasında kesin farklılıkları belirleyemediğini belirtmişlerdir. Bu çalışma da Besnard ve ark. (2001), 102 zeytin. çeşidinde RAPD primerleri ile çeşitler arasındaki genetik ilişkiyi belirlemişlerdir. 45 RAPD primeri kullanılan bu çalışmada 24 filogenetik salkım ortaya çıkmıştır. 45 primer arasında sadece 5 tanesi benzer profil ortaya çıkarmıştır. Cezayir, İspanya, Korsika ve îsrail bölgelerinden elde edilen örneklerde birbirinden uzak genotipler saptanmıştır. îtalya, Sicilya, Yunanistan ve Fransa çeşitleri arasında ve israil, Tunus ve Türkiye çeşitleri arasında birbirine benzer profiller elde edilmiştir, ispanya, Cezayir ve Korsika bölgelerindeki çeşitlerde yine birbirine benzer çıkmıştır. Bu şekilde 3 farklı çeşit grubunun olabileceği ileri sürülmüştür. De la Rosa ve ark. (2002), iki hetorozigot çeşit olan Leccino ve Dolce Agagia arasında geriye melezleme yaparak Fi döllerini elde etmişlerdir. Bu populasy ondaki farklılıkları ayırmak amacıyla RAPD ve AFLP markörleri kullanarak analiz yapmışlardır. Markörlerle her ebeveyni kapsayan haritalar oluşturmuşlardır. AFLP ve RAPD markerler haritalar içinde uygun bölgeleri bulmuşlardır. Fi dölleri 1:1 ayırarak ebeveyni belli olan ve olmayan haritalarını yapmak için bandlarm hesaplarını yapmışlardır. Her marker için resesif karakterleri de hesaba katmışlardır. 15 farklı 15primerİ birleştirerek toplam 166 AFLP marker elde etmişlerdir. Bunun 85* i Dolce Agagia, 81'ide Leccino'ya aittir. Bu markerler de belirtilen zincir halkalarında Leccino ve Dolce Agagia aralarında 26 ortak grup tespit etmişlerdir. RFLP gibi markerlerde kullanılan eşbaskınlık, ana ve babaya ait haritalarda genellikle birleştirmede kullanılacağını bildirmişlerdir. Ergülen ve ark. (2002), Ülkemizde yetiştiriciliği yapılan bazı standart yerli ve yabancı zeytin çeşitlerinin genetik benzerlik ve farklılıkları ile ilgili yaptıkları bir çalışmada önemli 10 standart zeytin çeşidi (Ayvalık, Domat, Gemlik, Halhali, Kilis Yağlık, Manzanilla, Memecik, Nizip Yağlık, Sarı Ulak ve Tavşan Yüreği) incelemişlerdir. Bu çalışmada bitkisel materyal olarak Bornova Zeytincilik Araştırma Enstitüsü' ne ait koleksiyon bahçesinde bulunan 3 adet Ege, 1 adet Marmara, 2 adet Akdeniz ve 3 adet Güneydoğu Anadolu Bölgesi çeşidi ile 1 adet İspanyol çeşidi kullanılmış ve genetik varyasyonları RADP-PCR tekniği kullanarak belirlemişlerdir. Buna göre Domat ile Gemlik ve Nizip Yağlık ile Manzanilla birbirine yakın akraba bulunurken, San Ulak ve Ayvalık en uzak akraba olarak ortaya çıktığı; Derik Halhali çeşidinin ise bütün çeşitlere en uzak akraba olduğu ve diğer çeşitlerden oldukça farklılık gösterdiği belirtilmiştir. Kamoun ve ark. (2002), Tunus'un güney ve kuzey, bölgelerinde morfolojik ve pomolojik yönden önemli olan 18 zeytin çeşidinin (5 çeşidi Chemlali) genetik özelliklerini incelemek amacıyla genetik marker tekniklerinden izoenzim sistemini kullanmışlardır. Yatay nişasta jel elektro forezinde, enzim ekstraksiyonu için yaprak dokularım, enzim sistemi olarak da Lösin amino peptidaz ve Esteraz'ı kullanmışlardır. Sonuç olarak 3 polimorfik locus da 8 adet allel belirlemişler. 18 zeytin çeşidinden 6 tanesinin birbirlerinden farklı olduğunu tespit etmişlerdir. 2 enzim sisteminde `Chemlali Tataouine`, `Chemlali Djerba` ve `Chemlali Zarsiz` nin benzer özellikler gösterdiğini ve `Chemlali Sfax`ın `Chemlali North`dan farklı olduğunu belirtmişlerdir. 163. MATERYAL ve YÖNTEM 3.1. Materyal Çalışmada kullanılan bitkisel materyaller, Çanakkale Onsekiz Mart Üniversitesi Ziraat Fakültesi zeytin koleksiyon bahçesi ve Edremit Zeytincilik Üretme İstasyonu tesislerinde bulunan fidan, ağaç ve zeytin delicelerinden alınmıştır. Zeytin çeşit, tip ve delicelerine ait genç sürgün uçları, yapraklar, floem, mezokarp ve endosperm dokuları izoenzim ekstraksiyonu yapmak amacıyla materyal olarak kullanılmıştır.Çalışmada, Türkiye'de yaygın şekilde yetiştiriciliği yapılan yağlık ve sofralık yerli çeşitler, bazı yabancı çeşitler ile Ülkemizde zeytin seleksiyonu çalışmaları gerçekleştiren Atatürk Bahçe Kültürleri Merkez Araştırma Enstitüsü (Yalova) ve Zeytincilik Üretme İstasyonu (Edremit - Balıkesir) tarafından seçilen tipler kullanılmıştır. Bu çalışma kapsamında materyal olarak kullanılacak bazı zeytin çeşit ve tiplerinin özellikleri kısaca Çizelge l'de gösterilmiştir. 17t* (D N O B '3 `S co o N CQ I es S CO `3 8> J5J0 13.aÇizelge 2. İzoenzim polimorfizmleri incelenen zeytin çeşit ve tipleri 1. Ayvalık (standart) 2. Ayvalık-TI 3. Ayvahk-T2 4. Ayvalık-T3 5. İzmir Sofralık 6. Kiraz 7. Arbequine 8. Gemlik (standart) 9. Gemlik 12-2 10. Gemlik 20-1 11. Gemlik 20-5 12. Gemlik 20-6 13. Gemlik 20-7 14. Samanlı 15. Kilis Yağlık 16. NeoraL 17. Hojiblanca 18. Karamürsel Su 19. Edincik Su 20. Uslu 21. Eğriburun 22. Tavşan Yüreği 23. Ak delice- 1 24. Ak delice-2 25. Ak delice-3 26. Çakır Yağlık 27. Çekişte 28. Halhali 29. Gordaies 30. Leccio 31. Kan Çelebi 32. Nizip Yağlık 33. Verdial 34. Lucques 35. Ascolana 36. Memecik 37. Memecik 2-3 38. Ak delice-4 39. Ak delice-5 40. Domat 41. Manzanilla 42. Çilli 43. Erkence Çalışmada Çizelge 2. de verilen 28 adet yerli ve yabancı zeytin çeşidi, 5 adet Gemlik tipi, 3 adet Ayvalık tipi, 1 adet Memecik ve 5 adet Ak delice tipinden çeşit polimorfrzmini incelemek amacıyla doku örnekleri alınmıştır. Memecik, Ayvalık, Gemlik ve Domat en önemli yerli çeşitlerimiz arasında yer almaktadır. Bu çeşitlere ait görüntüler Şekil 3., 4., 5. ve 6. da verilmiştir. 20I- 99999 I Şekil 3. Memecik çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri I Aİ«MM ' 5 İdi Ayvalık Şekil 4. Ayvalık çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri 21IN...ft........... Şekil 5. Gemlik çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri Mm ti I İlli Şekil 6. Domat çeşidinin meyve ve yaprak özellikleri 223.2. YÖNTEM 3.2.1. İzoenzim Sistemleri Çalışmada zeytinlerde izoenzimatik polimorfızm oluşturabilen ve Çizelge 3. de verilen izoenzim sistemleri kullanılmıştır. Çizelge 3. Zeytinlerde genotipik tanılamada kullanılan izoenzim sistemleri 3.2.2.Doku Seçimi Elektroforez uygulamaları birçok bitki organından elde edilen ekstraksiyonlarla başarılı sonuçlar vermektedir. Bununla birlikte çalışılan bitki için en uygun dokuların ön denemelerle saptanması gerekmektedir. Aynı bitki kökenli farklı dokuların benzer izoenzim profilleri oluşturmasına karşın, çevre koşullarından ve dokunun fizyolojik durumundan etkilenebilen enzim sistemleri için bu durum dikkat gerektirmektedir. Çalışmada genç sürgün uçları, yaşlı yaprak, genç yaprak, floem, mezokarp ve endosperm dokuları test amacıyla kullanılmıştır (Şeker, 1999). 3.2.3. Nişasta Jelinin Hazırlanması Nişasta jeli elektroforez işleminden 1 gün önce hazırlanmıştır. 1000 mi lik erlenmayer içerisine nişasta, elektrolitik tampon çözeltisi ve dfbO eklenerek yaklaşık 300 °C lik manyetik karıştırıcı üzerinde yarı saydam bir görüntü kazanmeaya kadar karıştırılarak kaynatılmıştır. Bu karışımın içerisindeki gaz bir musluk vakumu yardımıyla alınmış ve elektroforez küvetine boşaltılarak soğumaya bırakılmıştır (Şeker, 1999). 233.2.4. Doku Örneklerinin Toplanması Tüm elektroforez uygulamalarında bitkilerden üzerinde hastalık, zararlı simptomları taşımayan ve bitki besin elementi eksiklikleri göstermeyen sağlıklı dokular toplanmıştır. Toplanan dokular saf su ile temizlendikten sonra +4 C de korumaya alınmışlardır. Her analiz için daima taze dokular kullanılmıştır (Şeker, 1999). 3.2.5. Enzim Ekstraksiyunların Hazırlanması Bitki ekstraksiyonu daha önceden 0 °C de soğutulmuş porselen havanlar içerisinde hazırlanmıştır. Genotiplere ait yaklaşık 200 mg doku örneği porselen havan içerisine konularak üzerine antioksidantlar (Merkapto ethane!. L-sistein), ekstraksiyon tampon çözeltisi, PVPP (PolivimT polipirolidon) ve 25 mg deniz kumu eklenmiştir. Ezici yardımıyla hızlı bir şekilde doku parçaları homojen olarak ezilmiş ve bu ekstraksiyon 1,5 mi lik santrifüj tüplerine aktarılmıştır. Yaklaşık 20 genotipe ait ekstraksiyon bu şekilde hazırlandıktan sonra 15 dakika süreyle 13000 d/dak lık hızda ve +4 °C sıcaklıkta santrifüjlenerek saflaştırma işlemi gerçekleştirilmiştir (Şeker, 1999). 3.2.6. Enzim Ekstraksiyonlarının Jel İçerisine Yerleştirilmesi Her bir genotipe ait izoenzim ekstraksiyonundan yaklaşık 50 ul alınarak 10x5 mm boyutlardaki Whatman filtre kağıtlarına emdirilmiş ve bu filtre kağıtları 5 mm aralıklarla jel üzerine dizilmişlerdir (Şeker, 1999). 3.2.7. Elektroforezin Başlatılması Elektroforez işlemi bir buzdolabının +4 °C lik bölmesinde yaklaşık 5-6 saat sürecinde gerçekleştirilmiştir. Jele elektrik enerjisi verilmeden önce elektroforez anot ve katot küvetlerinin içerisine yaklaşık 150 mi elektrolitik tampon çözeltisi konulmuş ve bu küvetlerin üzerine de bitki ekstraksiyonlarına ait filtre kağıtlarının dizili bulunduğu tarafın katot yönüne gelmiş olmasına dikkat edilmiştir. Jel küveti plastik film ve cam ile kapatılarak en üste ısınmayı önlemek amacıyla soğutma kutuları yerleştirilmiştir. Jetlere 45 mA ve 150 V doğrugerilim (DC) verilmiş ve bu işlem yaklaşık 5 ya da 6 saat süresince devam ettirilmiştir. Jel üzerindeki soğutucu kutular l'er saat aralıklarla yenilenmiştir (Şeker, 1999). 3.2.8. Jelin 1 mm Kalınlığında Dilimlere Ayrılması Elektroforez işleminin tamamlanmasının ardından jel özel bir kesici yardımıyla yaklaşık 1 mm kalınlıkta dilimlere ayrılmış ve bu jel kesitleri izoenzim sistemlerinin çalışılacağı boyama kaplarına konulmuştur (Şeker, 1999). 243.2.9. Jel Dilimlerinin Farklı Enzimler İçin Boyanması Bu jellerin üzerine 50'şer mi izoenzim sistemlerine özel tampon çözeltileri konulmuş ve üzerleri ışıktan zarar görmelerini engellemek için kapatılarak yaklaşık 10 dakika bekletilmiştir. Daha sonra tampon çözeltileri kaplardan boşaltılmış ve jellerin üzerine farklı enzim sistemleri için boyama solüsyonları konulmuş ve üzerleri kapatılarak 38 °Clik etüvde inkübe edilmiştir (Şeker, 1999). Enzim sistemlerinin boyanması için kullanılan kimyasallar, konsantrasyonları ve kullanılan miktarları Çizelge 3. de, elektroforez uygulamalarının bazı bölümleri ile ilgili resimler Şekil 6, da verilmiştir (Şeker, 1999). 3.2.10. Jel Fiksasyonu Jellerin boyanma işlemleri bittikten ve izoenzim bantlarının net bir şekilde görünmesinden sonra boyama solüsyonu temizlenmiş ve üzerine % 5 lik asetik asit çözeltisi konularak fıksasyonları sağlanmıştır (Şeker, 1999). Çalışma süresince gerçekleştirilen izoenzim analizlerine ait her aşamada Torres ve ark. (1978), Yndgaard ve Hoskuldson (1985), Pasteur ve ark. (1987), Lebrun ve ark. (1988) ile Ollitrault ve ark. (1992), tarafından bildirilen yöntemler ve modifikasyonları kullanılmıştır (Şeker, 1999). 3.2.11. Jellerdeıı Veri Toplama ve Veri Analizi Farklı izoenzim sistemlerinden elde edilen profillerde toplam allel sayıları, allel numaraları belirlenmiş ve her bir genotip için kaydedilmiştir. Allel numaralan 'W1NSTAT' genetiksel ilişkiler yazılımına uygun formata göre 0.0 (allel bulunmaması), 0.5 (heterozigot allel) ya da 1.0 (homozigot allel) kodları kullanılarak bilgisayara aktarılmıştır. Çalışmadan elde edilen verilerle 'Distance of Euclidian' ve 'Neighboor Joining Method' istatistiksel analizleri yapılarak dendrogramlar oluşturulmuştur (Sneath ve Sokal, 1973; Şeker, 1999). 25a) Nişasta jeli hazırlığı b) Ekstraksiyonların hazırlanması c) Enzimlerin jel içine yerleştirilmesi d) +4 `C de elektroforez işlemi ?EH**. İli e) Elektroforez güç kaynağı f) Enzimlerin inkübasyonu Şekil 7. tzoenzim analizlerinin önemli aşamaları 26Çizelge 4. tzoenzim sistemleri için kullanılan boyama solüsyonları a) Fosfogluko izomeraz (PCI) b) Alkol dehidrogenaz (ADH) c) Malat dehidrogenaz (MDH) d) Izositrat dehidrogenaz (IDH) 27Çizelge 4 (devam). İzoenzim sistemleri için kullanılan boyama solüsyonları e) Fost'ogluko mutaz (PGM) f) Peroksidaz (PRX) Kullanılan miktar 1 mi 25 mi 250 ul 50 ml'ye tamamlanır. Kullanılan kimyasallar Guaicol Tris MalatpH 5.4 Hidrojen peroksit dH.O Konsantrasyon 284. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1. Zeytin Dokularının İzoenzim Analizlerinde Kullanılabilirliği Laboratuar uygulamalarının ve enzim ekstraksiyon yönteminin zeytin türüne adaptasyonu amacıyla değişik kimyasal ve farklı doku çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar kapsamında zeytin çeşitlerinin izoenzim analizlerinde kullanılması gereken en uygun canlı dokusu ve kullanılması gereken kimyasal maddelerin belirlenmesi için ön denemeler gerçekleştirilmiştir. Çalışmada zeylin fidan ve ağaçlarına ait yaşlı yaprak, genç yaprak, floem, sürgün ucu, genç meyvelerden alınan mezokarp ve endosperm dokuları en uygun dokunun belirlenmesi amacıyla değerlendirilmiştir. Zeytin dokularının diğer meyve türlerinden farklı bir şekilde çok yüksek oranlarda fenolik bileşikler içermesi, çalışılan enzim sistemleri için kullanılan enzim ekstraksiyonlarımn ortam sıcaklığından çok hızlı bir şekilde olumsuz etkilenmesi ve hızla kararma (oksidasyon) göstermesi nedeniyle belirtilen analiz yöntemlerinde önemli modifikasyonların yapılması zorunluluğu doğmuştur. Dokularda bulunan yüksek konsantrasyonlardaki sekonder metabolitler analizler süresince sıklıkla oksidasyon problemlerinin oluşmasına neden olmuştur ve diğer bitki türlerinde yapılan analiz yöntemlerinden çok daha yüksek miktarlarda kimyasal sarf malzemesi kullanılmıştır. Ekstraksiyon aşamasında kullanılan antioksidantların kullanım miktarı ve çeşitliliği önemli düzeyde arttırılmış, ekstraksiyon, santrifüj ve elektroforez işlemleri sırasında ortam sıcaklığının sürekli olarak +4 °C ve altında kalmasına özen gösterilerek oksidasyon sorunu (kahverengileşme ve kararma) ortadan kaldırılmıştır. Oksidasyon problemi dışında, zeytinlerde tüm canlı dokuların izoenzim analizleri için uygun olmadığı da görülmüştür. Analizler sırasında en iyi enzim ekstraksiyonu elde etmek için fenolik bileşiklerin çok yüksek konsantrasyonlarda bulunmadığı genç sürgün ucu dokularının uygun olduğu görülmüştür. 4.2. İzoenzim Sistemlerinin Genel Değerlendirmesi Çalışma süresince incelenmesi amaçlanan 29 adet yerli ve yabancı zeytin çeşidi, 5 adet Gemlik tipi, 3 adet Ayvalık tipi, 1 adet Memecik tipi ve 5 Ak delice (43 adet zeytin genotipi) 6 farklı enzim sistemine ait profilleri başarılı bir şekilde elde edilmiştir. 29Çalışma süresince elde edilen profiller zeytin türü içinde yüksek düzeyde izoenzimatik varyasyon olduğunu göstermiştir. Allel sayısının yüksek olması zeytin türünün yüksek düzeyde heterozigotik yapıya sahip olduğunu göstermektedir. Her bir izoenzimden elde edilen lokus ve allel sayısı sistemlere göre değişiklik göstermiştir. Elektroforez süresince daha hızlı ilerleyen ve (+) bölgesine yakın sıralanan bantların oluşturduğu boyanma bölgesi 1.. daha yavaş ilerleyen ve jelin (-) bölgesine yakın boyanan bölge ise 2. lokus olarak değerlendirilmiştir. Her bir lokusta saptanan alicilere de (-) bölgesine yakın banttan başlamak üzere (1 nolu allel; 2 nolu allel; 3 nolu allel) numaralar verilmiştir. Diğer taraftan, izoenzim bantlarının yorumlanabilir olması da sistemlere göre değişiklik göstermiştir. Aşağıda genel olarak her bir izoenzim sisteminden şimdiye kadar elde edilen sonuçlar özetlenmiştir. a) Fosfogluko izomeraz (PGI) : Bu izoenzim sisteminde tüm zeytin genotipleri göz önünde tutulduğunda 1 adet lokus ve 4 adet allelin bulunduğu belirlenmiştir. Genotiplerin çoğu heterozigot yapı sergilemiştir. b) Alkol dehidrogenaz (ADH) : En az sayıda allel bu izoenzim sisteminden elde edilmiştir. Tek lokusta toplam 2 allelin bulunduğu ve genel olarak genotiplerin tek bant oluşturduğu belirlenmiştir. Zeytin türünün ADH sistemi bakımından homozigot yapıya sahip olduğu görülmüştür. c) Malar, dehidrogenaz (MDH) : 2 farklı lokusta oluşan bu izoenzim sistemi MDH-1 ve MDH-2 olarak isimlendirilmiştir. Her bir lokusta 3 er adet allel belirlenmiştir. Bu sistem bakımından incelenen tüm bitkiler genellikle heterozigotik yapı sergilemiştir. d) Izositrat dehidrogenaz (IDH) : Genotiplerin IDH sisteminde 1 ya da 3 bant oluşturduğunu ve bantların 1 lokusta yer aldığını göstermiştir. Bu lokusta tüm genotipler için elde edilen toplam allel sayısı 4 tür. Bu sistemde hem heterozigoti hem de homozigoti ile sıklıkla karşılaşılmıştır. e) Fosfogluko mutaz (PGM) : Bu izoenzim sisteminde 2 farklı renklenme bölgesi (lokus) gözlemlenmiş ve lokuslar PGM-1 ve PGM-2 olarak değerlendirilmiştir. Birinci lokusta 4 adet allel belirlenmiş, ancak 2. lokus yorumlanabilir profil oluşturmadığı için değerlendirmede kullanılmamıştır. f) Peroksidaz (PRX) : Bu izoenzim sistemi diğer sistemlerden farklı olarak koyu kırmızı renkli bantlar oluşturmuştur. Tek renklenme bölgesinin oluştuğu sistemde 3 adet allel belirlenmiştir. 30Analizler süresince PG1, ADH, IDH, MDH ve PRX sistemlerinde görülen polimorfızm örneği Şekil 8. de gösterilmiştir. Şekil 8. Zeytinlerde değişik izoenzim sistemlerinden elde edilen polimorfızm örnekleri 31Elde edilen sonuçlar zeytin populasyonunda belirlenen toplam 8 adet tokusun 7' sinde 23 adet allelin bulunduğunu göstermektedir. İzoenzim sistemlerine göre lokus ve allel sayıları Çizelge 5. te gösterilmektedir. Çizelge 5. Zeytin populasyonunda belirlenen ve farklı izoenzim sistemlerine ait lokus ve allel sayıları 4.3. Zeytin Çeşitleri İzoenzim Analiz Sonuçları Çalışmada incelenen 29 adet yerli ve yabancı çeşit, 5 adet Gemlik tipi, 3 adet Ayvalık tipi. 1 adet Memecik tipi ve 5 Ak deliceye ait populasyon (toplam 43 adet zeytin genotipi) izoenzim polimorfızmi sergilemiştir. Yapılan analizler zeytin çeşit ve tiplerinin 7 lokusta toplam 23 allele sahip olduğunu göstermiştir (Çizelge 5). Çalışmada incelenen Gemlik, Ayvalık ve Memecik çeşitlerinden klonal seleksiyon ile elde edilen Gemlik 12-2, Gemlik 20-1, Gemlik 20-5, Gemlik 20-6, Gemlik 20-7, Ayvalık-Tl. Ayvalık-T2, Ayvalık-T3 ve Memecik 2-3 klonlannın ana çeşitler ile gösterdikleri genetiksel farklılıklar belirlenememiştir. Klonlar ana çeşitleri ile benzer profilleri oluşturmuştur. Bu tiplerin ana çeşitlerden farklı özellik taşımalarının nedenleri olarak periyodisiteye eğilimlerinin düşük olması ve üstün meyve özellikleridir. Periyodiste ve meyve kalitesinin zeytin türünde son derecede önemli karakterler olmasına karşın bu özelliklerin izoenzim profilleri ile ortaya çıkarılması mümkün olmamıştır. Dolayısıyla, farklı bölgelerden üstün özellikleri nedeni ile seçilen bu tipler melez zeytin özelliği taşımamaktadır. Bu tiplerin özellikle zeytin türünün genom haritasının çıkarılmasında önem taşıyabileceği düşünülmekte ve AFLP gibi PCR tabanlı DNA analizleri yapılarak bu tiplerin genetiksel özelliklerinin belirlenmesi 32gerektiği önerilmektedir. Bu tiplerin ortaya çıkmasında nokta mutasyonların olumlu etkileri nedeniyle bir değişimin gerçekleştiği ve ana çeşitlerden farklılıklar taşıdığı ileri sürülebilir. Daha önce de belirtildiği gibi incelenen izoenzim sistemleri zeytin çeşitleri populasyonunda değerlendirilebilir polimorfizm ortaya koymuştur. Aşağıda genel olarak her bir izoenzim sisteminden elde edilen sonuçlar özetlenmiştir. a) PGI sistemi : PGI profiline göre çeşitler 7 farklı gruba ayrılmıştır. Bu izoenzim sistemine ait elde edilen 4 adet allelin oluşturduğu model görüntü Şekil 9. da verilmiştir. En sık 1., 2. ve 3. allellerin izlendiği bu sistemde çeşitlerin çoğu heterozigotik çoklu bant yapısı sergilemiştir. 31 adet çeşitten 7-'si homozigot olarak bulunmuştur. Homozigot çeşitlerden Leccio, Halhali ve Kilis Yağlık sadece 2. allele, İzmir Sofralık, Çilli, Tavşan Yüreği ve Kan Çelebi çeşitleri ise 4. allele ait profili sergilemiştir. İncelenen çeşitlerde sadece 1. ve 3. alleli taşıyan homozigot çeşit görülmemiştir. Şekil 9. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen PGI izoenzim model profili b) ADH sistemi : Sadece 2 adet allelin elde edildiği ADH sisteminde çeşitlerin tek bantlı homozigotik yapıya sahip oldukları belirlenmiştir (Şekil 10). Çeşitler 2 grup oluşturmuş ancak, çeşitlerin büyük çoğunluğu (25 çeşit) 2 nolu allele ait profili ortaya koymuştur. Kan Çelebi, Halhali, Çekişte, Verdial, Hojiblanca ve Neoral çeşitleri 1. allele ait profili sergilemiştir. 33Şekil 10. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen ADH izoenzim model profili c) MDH sistemi : MDH sisteminde 2 farklı lokusta oluşan profiller tüm çeşitler için heterozigotik yapı sergilemiştir. Ancak sadece, MDH-1 lokusunda bazı genotipler homozigot profil oluşturmuştur. Çeşitler MDH profilleri bakımından birbirlerine yakın allellere sahip olmuşlardır. Bu sistemde, Ayvalık çeşit ve tipleri, Çilli, izmir Sofralık, Tavşan Yüreği, Domat ve Leccio çeşitlerinde MDH-1 lokusunda 2. allel; Nizip Yağlık, Kan Çelebi, Memecik ve Ascolana çeşitlerinde ise yine aym lokusta 1. ve 2. alleller görülmesi nedeniyle diğer tüm çeşitlerden farklı profil görülmüştür. MDH-2 lokusunda ise tüm çeşit ve tiplerin 2 nolu allele sahip oldukları belirlenmiştir. MDH sistemi genel olarak 7 farklı profilin görüldüğü bir sistem olmuştur (Şekil 11). Şekil 11. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen MDH izoenzim model profili 34d) IDH sistemi : IDH sisteminde belirlenen 4 adet allel yüksek düzeyde polimorfızmin görülmesine neden olmuştur. Samanlı, Edincik Su, Gemlik, Erkence, Kiraz, Tavşan Yüreği, Karamürsel Su, Memecik, Çilli, Eğriburun ve Lucques çeşitleri homozigot, diğer çeşitler ise heterozigotik yapı göstermiştir. Homozigot çeşitlerden sadece Memecik 2 nolu alleli, diğerleri ise 3 nolu alleli göstermiştir. Bu sonuç yerli zeytin çeşitlerinde homozigotinin daha yüksek olduğunu göstermektedir. IDH profillerinde en sık 3 nolu allelle karşılaşılmış ve 7 farklı grup elde edilmiştir (Şekil 12). Şekil 12. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen IDH izoenzim model profili e) PGM sistemi : PGM izoenzim sistemine ait elde edilen 4 adet allelin oluşturduğu model görüntü Şekil 13. te verilmiştir. PGM desenlerine göre çeşitlerin 5 farklı grup oluşturduğu saptanmıştır. Çeşitler arasında en sık 2. ve 3. alleller izlenmiştir. PGM profilinde 4. allel sadece Nizip Yağlık, Kan Çelebi ve Ascolana çeşitlerinde izlenmiştir. Bu sistemde zeytin çeşitleri genellikle heterozigot yapı sergilemelerine PGM Şekil 13. Zeytin çeşit populasyonunda izlenen PGM izoenzim model profili 35