Oncorhynchus mykiss walbaum, 1792 (Osteichthyes:salmonidae)`nin karaciğer ve incebarsak lipaz enziminin purifikasyonu ve bazı kinetik özelliklerinin incelenmesi

Abstract

ÖZET DOKTORA TEZİ ONCORHYNCHUS MYKISS WALBAUM, 1792 (OSTEICHTHYES: SALMONIDAE)' NİN KARACİĞER VE İNCEBARSAK LİPAZ ENZİMİNİN PURİFİKASYONU VE BAZI KİNETİK ÖZELLİKLERİNİN İNCELENMESİ Kubilay METİN Cumhuriyet Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman Doç. Dr. M. Ali AKPINAR Bu çalışmada, Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792'nin karaciğer ve incebarsak lipazmın saflaştırılması ve bazı kinetik Özellikleri araştırılmıştır. Karaciğer ve incebarsak triaçilgliserol lipazmın hücrenin sitoplazmik kesitinde bulunduğu saptanmıştır. Bu dokuların lipazlan, Sefadeks G-100 jel filtrasyonu ile kısmi olarak saflaştınldı ve saflaştırma katsayısı karaciğer lipazı için 19.61 ve incebarsak lipazı için ise, 14.35 kat olduğu saptanmıştır. Poliakrilamid jel elektroforezi ile karaciğer lipazının 55.000, incebarsak lipazmın 62.000 Dalton molekül ağırlığına sahip olduğu belirlenmiştir. Her iki doku lipazmın aktivitesi 32 °C de optimum olduğu ve karaciğer lipazının pH 8.00 de, incebarsak lipazmın ise pH 8.50 de maksimum aktivite gösterdiği belirlenmiştir. Substrat olarak pNPA kullanıldığında karaciğer lipazı için Vmax değeri 0.43 U/mg protein, Km değeri ise 0. 14 mM pNPA ve incebarsak lipazı için sırasıyla 4.35 U/mg protein, 0.81 mM pNPA olarak hesaplanmıştır. Her iki dokunun lipaz aktivitesi üzerine tek (NaCl ve KC1) ve iki (CaCl2 ve MgCl2) değerlikli metal iyonlarının aktive edici bir etki yaptıkları saptanmıştır. Safra tuzu olan Na-taurodeoksikolatın karaciğer ve incebarsak lipaz aktivitelerini inhibe ettiği ve Na-deoksikolat ise karaciğer lipaz aktivitesini inhibe etmekte iken, incebarsak lipaz aktivitesini aktive ettiği belirlenmiştir. Bir kelat ajanı olan EDTA ise, karaciğer lipaz aktivitesini 4 mM derişime kadar etkilememekte iken 5 mM da bir artış meydana getirmiştir. İncebarsak lipaz aktivitesi ise 0.6 mM derişime kadar hiç etkilenmemiş, daha üst derişimlerde inhibe olduğu görülmüştür. Anahtar Kelimeler: Oncorhynchus mykiss, triaçilgliserol lipaz, karaciğer, İncebarsak

11 SUMMARY Ph. D. PURIFICATION OF LIPASE FROM LIVER AND INTESTINE IN ONCORHYNCHUSMYKISS WALBAUM, 1792 AND INVESTIGATION OF THEIR SOME KINETIC PROPERTIES Kubilay METİN Cumhuriyet University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor Ass. Prof. Dr. M. Ali AKPINAR In the present study, liver and intestinal lipase from Oncorhynchus mykiss Walbaum, 1792 were purified and some of their kinetic properties were investigated. Liver and intestinal triacylglycerol lipase were found to be located in the cytoplasmic fraction of cells. Lipase were partially purified using Sephadex G-100 gel filtration from these tissues and purification coefficient were found 19.61 fold for liver lipase and 14.35 fold for intestinal lipase. Molecular weights of liver and intestinal lipase, determined by polyacrylamide gel electrophoresis, were found 55.000 and 62.000 Dalton, respectively. Lipase activity from both tissues were optimal at 32 °C and lipase activity was highest at pH 8.00 for liver lipase and at pH 8.50 for intestinal lipase. When pNPA was used as a substrate, Vmax value was estimated 0.43 U/mg protein and Km value 0.14 mM pNPA for liver lipase.. Vmax value were 4.35 U/mg protein and Km 0.81 mM pNPA for intestinal lipase. Monovalent (NaCl ve KC1) and divalent (CaCİ2 ve MgCfe) metal ions were established as an activated factor on both liver and intestinal lipase. Although Na-taurodeoksicolat, one kind of bile salt, inhibited liver and intestinal lipase activity, another kind of bile salt, Na-deoksicolat, inhibited liver lipase and activated intestinal lipase. While EDTA, an chelat agent, did not affect on the activity of liver lipase enzyme up to 4 mM, an increase in the activity of the enzyme was established at 5 mM EDTA On the other hand, activity of intestinal lipase did not affected at 0.6 mM but was inhibited at higher concentrations of EDTA Key Words: Oncorhynchus mykiss, triacylglycerol lipase, liver, intestine