Lektin afinite kromatografisi ile antikor saflaştırılması

Abstract

Bu çalışmada, Konkanavalin A (Con A) immobilize eş boyutlu manyetik poli-glisidil metakrilat (GMA) mikropartiküller kullanılarak, kesikli ve MSFB (Manyetik olarak kararlılaştırılmış akışkan yatak) sistemde sulu çözeltiden ve insan serumundan IgG (İmmünoglobulin G) saflaştırılması çalışıldı. M-poli(GMA) eş boyutlu mikrokpartiküller, Fe3O4 nanopartikül varlığında dispersiyon polimerizasyon yöntemi ile sentezlendi. FT-IR, 1H NMR, SEM, ESR, VSM analizleri m-poli(GMA)'nın karakterizasyonu için kullanıldı.Manyetik eş boyutlu poli(GMA) mikropartiküllerdeki epoksi halkaları alkali koşullarda açılarak Con A hidroksil uzantılarından mikropartiküle kovalent olarak bağlandı. Maksimum Con A immobilizasyon değeri pH 7.4 (0,1 M fosfat tamponu)'de 4 oC'de 12.5 mg g-1 olarak bulundu. M-poly(GMA)-Con A mikrokürelere kesikli ve MSFB sistemde maksimum IgG adsorpsiyon kapasiteleri sırasıyla 35.5 ve 37.7 mg g-1, olarak saptandı. Her iki sistemde de maksimum IgG adsorpsiyon kapasitesi pH 6.0'da (0.1 M fosfat tamponu) saptandı. MSFB sistemde, akış hızı ve manyetik alan çalışmaları da yapıldı. Adsorpsiyon kapasitesi, akış hızı 1.0'den 4.0 mL dak-1' ya yükseldikçe 37.7'den 10.9 mg g-1 değerine düşmektedir. Manyetik alan artırıldığında ise, artan manyetik alan neticesinde adsorplanan IgG değeri 37.7'den 18.0 mg g-1 değerine düşmüştür. Her iki sistemde polimerik mikropartiküle adsorplanan IgG'nin desorpsiyonu için etilen glikol + glukoz kullanılarak gerçekleştirildi. Aynı partikül kullanılarak yapılan on tekrarlı adsorpsiyon- desorpsiyon döngüsü sonucunda partikülün adsorpsiyon veriminde anlamlı değişme olmadığı görüldü.M-poli(GMA)-Con A kullanılarak insan serumundan yapılan IgG adsorpsiyon çalışmaları sonucu gram partikül başına maksimum adsorpsiyon 48 mg g-1 olarak bulundu. 2.0 M NaCl insan serumundan saflaştırma çalışmalarında partiküle adsorplanan IgG'nin desorplanmasında desorplayıcı ajan olarak kullanıldı. Saflaştırılan IgG'nin saflık kontrolü ise SDS-PAGE yöntemi ile yapıldı. Kan çalışmaları ve desorpsiyon çalışmaları sonucunda ölçümlerin hepsi ELISA yöntemi kullanılarak yapıldı. Adsorpsiyon ve desorpsiyon çalışmaları süresince IgG molekülünün yapısında değişme olup olmadığı spektroflorimetrik çalışmalar ile araştırıldı.Çalışmaların son kısmını oluşturan SPR (Yüzey Plazmon Rezonans) çalışmaları ise Con A ve IgG arasındaki etkileşimin kinetik açıdan incelendiği aşamadır. Bu amaç doğrultusunda SPR çipe immobilize edilen Con A ile önce plazmon açısı saptandıktan sonra kinetik çalışmalar yapıldı. Kinetik ve bağlanma sabitlerinin bulunabilmesi için kinetik veriye üç farklı izoterm (Langmuir, Freundlich ve Langmuir-Freundlich) uygulandı. Sonuçlardan en uygun grafiğin Langmuir olduğu anlaşıldı.Anahtar Kelimeler: m-poli(GMA), ConA immobilizasyon, dispersiyon polimerizasyon, lektin afinite kromatografisi, IgG saflaştırma.

In this study, purification of human immunoglobulin-G (IgG) from aqueous solutions and human serum were studied by using Con A immobilized m-poly-glycidyl methacrylate (GMA) monosize microbeads. M-poly(GMA) monosizes microbeads were prepared by dispersion polymerization in the presence of Fe3O4 nanopowder. FT-IR, 1H NMR, SEM, ESR, VSM were used for characterization of the m-poly(GMA) microbeads.The epoxy ring of m-poly(GMA) microbeads were opened in alkali conditions. Con A was immobilized by covalent binding onto epoxy ring opened m-poly(GMA) beads via hidroxyl groups. Maximum Con A immobilization value was 12.5 mg g-1 at pH 7.4 (0,1 M phosphate buffer), at 4 oC. The maximum IgG adsorption capacity on m-poly(GMA)-Con A beads in batch system and MSFB system were 35.5 and 37.7 mg g-1, respectively. Maximum adsorption of IgG was observed at pH 6.0 (0.1 M phosphate buffer). In MSFB system, flow rate and magnetic field effect was also studied. The adsorption capacity decreased drastically from 37.7 to 10.9 mg g-1 with the increase of the flow rate from 1.0 to 4.0 mL min-1. When magnetic field was increased, adsorbed IgG was decreased from 37.7 to 18.0 mg g-1. In both system, desorption of adsorbed IgG on polymeric microbeads and reusability of microbeads were investigated by using ethylene glycole + glucose as desorption agent.The maximum IgG adsorption capacity on m-poly(GMA)-Con A beads from human serum was found 48 mg g-1. 2.0 M NaCl was used for desorption of adsorbed IgG on m-poly(GMA)-Con A microbeads from human serum. The purity of IgG was investigated by SDS-PAGE. All the measurements were performed by using ELISA techniques. Spectroflourimetric studies were done for investigating structural change of IgG at the course of adsorption and desorption studies.Last part of this study include of SPR (Surface Plasmon Resonance) kinetic studies between Con A and IgG molecules. For this aim, Con A was immobilized on SPR chip followed by detecting of plasmone angle and finally kinetic studies were done. In order to determine the kinetic and binding constant three different isotherms, Langmuir, Freundlich and Langmuir-Freundlich, were applied to kinetic data. As seen from the results Langmuir isotherm has high correlation constant.Key Words: m-poly(GMA), Con A immobilization, dispersion polymerization, lectin affinity chromatography, IgG purification.