Rhizopus delemar ile lipaz ve asit fosfataz enzimlerinin üretimi ve ağır metal biyobirikiminin eş zamanlı olarak incelenmesi

Abstract

Bu tez çalışmasında, R. delemar tarafından üretilen ve metal biyobirikiminde doğrudan rol oynayan asit fosfataz enzimi ve metal biyobirikiminde etkili olmayan lipaz enzimi üretimi incelenmiştir. Fermantasyon ortamına eklenen indükleyicilerin, yüzey aktif maddelerin ve inhibitörlerin lipaz aktivitesine etkisi incelenmiştir. Bazı ticari yağlar ve tribütirin indükleyici olarak kullanıldığında lipaz aktivitesi sırasıyla ayçiçek yağı> soya yağı >fındık yağı >mısır yağı> tribütirin zeytinyağı şeklinde azalmıştır. Ayrıca karıştırma hızı ve havalandırma oranının lipaz aktivitesine etkisi incelenmiştir. Yüzey aktif maddelerin lipaz aktivitesine etkisinin araştırılması için iki farklı yüzey aktif madde olan Tween-80 ve rhamnolipid, tribütirin ile karşılaştırmalı olarak incelenmiştir. Maksimum lipaz aktivitesi, indükleyici ve yüzey aktif madde olarak Tween-80 birlikte kullanıldığında elde edilmiştir. R. delemar' ın lipaz enzimi üretimi üzerine melas ve sakkarozun etkisi birlikte incelenmiştir. Aktivatörlerin varlığında lipaz aktivitesi NaCl > KCl > CaCl2 > MgCl2 > arap zamkı > EDTA şeklinde azalmış ve en yüksek aktivite 964.55 µmol/L-dak olarak elde edilmiştir. Fermantasyon ortamındaki ağır metal iyonlarının varlığı lipaz aktivitesini önemli ölçüde inhibe etmiştir. Ağır metal iyonlarının varlığında lipaz aktivitesi sırasıyla Fe(II) > Mn(II) > Co(II) > Ni(II) şeklinde azalmıştır.Benzer şekilde R. delemar' ın asit fosfataz enzimi üretmesi için uygun besin ortamı bileşenleri ve ortam pH' ı belirlenmiştir. Mikroorganizmanın her iki enzim aktivitesi üzerine ağır metal iyonlarının, Cu(II), Zn(II) ve Ni(II) etkileri incelenmiştir. Ağır metalsiz ortamda mikroorganizmanın maksimum-özgün (intrinsic) özgül üreme hızı (µm) ve Monod sabiti (Ks), 0649 sa-1 ve 1.8928 g/L olarak hesaplanmıştır. Asit fosfataz üretimi üzerine, ağır metal iyonlarının inhibisyonu sabiti ve maksimum görünür özgül üreme hızları bulunmuştur. Ni(II) ve Cu(II) iyonlarının R. delemar' ın üremesi üzerine etkisi yarışmalı inhibisyondur ve inhibisyon sabitleri sırasıyla 67.11 mg Ni(II)/L ve 82.30 mg Cu(II)/L olarak bulunmuştur. R. delemar' ın üremesi üzerine Zn(II) iyonunun inhibisyon tipi, kısmi yarışmalı inhibisyon ve inhibisyon sabiti, 179.21 mg Zn(II)/L olarak bulunmuştur.Michaelis?Menten sabitleri (Km) ve reaksiyonun ileri yöndeki maksimum hız sabiti (Vm), metal içermeyen ortamda sırasıyla 3.17 mM ve 833.3 µmol/L-dak olarak bulunmuştur. Ni(II) ve Cu(II) iyonlarının varlığı asit fosfataz aktivitesini inhibe etmiştir. Ni(II) ve Cu(II) iyonlarının reaksiyonun maksimum hızını, Vm, azaltması yarışmasız tip inhibisyon kinetiğine uyduğunu gösterir ve inhibisyon sabitleri sırasıyla 50 mg Ni(II)/L, 100 mg Cu (II)/L olarak hesaplanmıştır. Zn(II) iyonlarının spesifik üreme hızı ve R. delemar' ın asit fosfataz aktivitesi 25 mg/L Zn(II) konsantrasyonuna kadar artmış, bu derişimden sonra azalmaya başlamıştır. Asit fosfataz aktivitesi için Zn(II) iyonlarının inhibisyon tipi, yarışmasız-karışık tip inhibisyon olarak belirlenmiştir. Yarışmasız-karışık tip inhibisyon için Zn(II) iyonlarının inhibisyon sabiti 100 mg Zn(II)/L olarak belirlenmiştir.Çalışmanın bu aşamasında ise R. delemar' ın üreyen, üreme peryodunu tamamlamış ve kimyasal/ısıl olarak öldürülmüş hücrelerin Cu(II), Ni(II) ve Zn(II) iyonları için biyobirikim ve/veya biyosorpsiyon sonuçları karşılaştırılmıştır. Maksimum metal giderimi üreyen hücrelerde elde edilirken, en düşük metal giderim kapasitesi üreme peryodunu tamamlamış hücrelerde elde edilmiştir.R. delemar' ın üremesi, asit fosfataz aktivitesi ve metal biyobirikimi Cevap Yüzey Yöntemi (CYY) ve Box-Behnken deney dizaynı kullanılarak, pH, sıcaklık ve başlangıç metal iyonu konsantrasyonuna bağlı olarak optimize edilmiştir. Elde edilen matematiksel modeller, ANNOVA (Analysis of variance) istatistiksel yöntemi ile değerlendirilmiş, modellerin doğruluğu ve geçerliliği tartışılmıştır.

In this thesis study, the production of acid phosphatase enzyme which plays a role directly in metal bioaccumulation and lipase enzyme which does not participate directly in metal bioaccumulation by R. delemar were investigated. The effects of inducers, surface-active materials, activators, and inhibitors in the fermentation medium on lipase activity in R. delemar were investigated. In the presence of certain commercial oils and tributyrin as an inducer, lipase activity decreased in the order of sunflower oil > soybeanoil > hazelnut oil > corn oil > tributyrin > olive oil. In addition, the effects of the stirring and aeration rates on lipase activity were investigated. To investigate the effect of surface-active materials on lipase activity 2 different surface-active materials, Tween-80 and rhamnolipid (biosurfactant), were used as comparatives with tributyrin. Maximum lipase activity was observed in the fermentation medium containing Tween-80 as both an inducer and surface-active material. The combined effects of molasses and sucrose on lipase production by R. delemar were also investigated. Lipase activity in the presence of activators decreased in the order of NaCl > KCl > CaCl2 > MgCl2 > gum arabic > EDTA, and maximum lipase activity of 964.55 µmol/L-dak was obtained. The presence of heavy metal ions in the fermentation media severely inhibited lipase activity. Lipase activity in the presence of heavy metal ions decreased in the order of Fe(II) > Mn(II) > Co(II) > Ni(II).In a similar way, to produce acid phosphatase enzyme by R. delemar, the optimum growth medium components and pH were determined. The effects of heavy metal ions, Cu(II), Zn(II) and Ni(II) ions on acid phosphates activity were investigated. Maximum intrinsic specific growth rate (µm) and Monod constant (Ks) in metals-free medium were determined as 0.0649 h-1 and 1.8928 g/L. The inhibition type of heavy metal ions on acid phosphatase enzyme production was determined and the values of inhibition constant and the forward direction maximum reaction rates were found. The inhibition types of Ni(II) and Cu(II) ions on growth rate of R. delemar were found to be a competitive inhibition and the inhibition constants of Ni(II) and Cu(II) ions were found to be 67.11 mg Ni(II)/L and 82.30 mg Cu(II)/L, respectively. The inhibition type of Zn(II) ion on growth rate of R. delemar was found to be an uncompetitive inhibition and the inhibition constant of Zn(II) ion was found to be 179.21 mg Zn(II)/L.Michaelis?Menten constant (Km) and maximum forward velocity of the reaction (Vm) were determined as 3.17 mM and 833.3_mol/L min, respectively, in metal-free medium. In the presence of Ni(II) and Cu(II) ions,the activity of acid phosphatase was inhibited. Addition of Ni(II) and Cu(II) ions decreased the maximum reaction velocity, vm, showed noncompetitive-type inhibition kinetics and the inhibition constants were determined as 50 mg Ni(II)/L, 100 mg Cu (II)/L, respectively. The presence of Zn(II) ions on both the specific growth rate and acid phosphatase activity of R. delemar affected as activator up to 25 mg/L Zn(II) concentration, than the inhibition effect of Zn(II) ions began. The inhibition type of Zn(II) ions for acid phosphatase activity was found to be non-competitive mixed type inhibition. The value of non- competitive mixed type inhibition constant for Zn(II) ions was determined as 100 mg Zn(II)/L.In the next stage, the Cu(II), Ni(II) and Zn(II) bioaccumulation and/or biosorption studies by growing, resting and chemically/thermally killed cells of R. delemar were carried out, and the results were compared. Maximum metal removal was obtained by growing cells, while the resting cells have the lowest metal capacity.The growth and acid phosphatase activity of R. delemar and metal bioaccumulation were optimized by response surface methodology (RSM) and a Box-Behnken experimental design was used to study the interactive effects of pH, temperature and initial metal ion concentration on these input parameters. The mathematical models obtained were evaluated by Anova (Analysis of variance) statistical method, the accuracy and significance of these models were discussed.