Saccharomyces cerevisiae maya türünde NRG1 proteininin NTH1 gen ekspresyonuna etkisinin belirlenmesi

Abstract

İndirgenmemiş disakkarit olan trehaloz, Saccharomyces cerevisiae maya hücreleri tarafından enerji yedeği olarak normal koşullarda biriktirilir. Ayrıca farklı çevresel streslere karşı hücre içi trehaloz miktarının strese yanıt olarak artış gösterdiği bilinmektedir. Aynı zamanda, trehaloz, sinyal molekülü ve stres metaboliti olarak işlev görür. Stres koşulları sona erdiğinde ise biriktirilen trehalozun hızlı bir şekilde glukoza yıkımı gerçekleşir. Trehaloz şekerinin sentezi TPS enzim kompleksi ile gerçekleşirken, yıkımı ise nötral trehalaz enzimi tarafından gerçekleşir ve hücre içerisindeki miktarı belli bir seviyede tutulur. Bu nedenle trehaloz metabolizmasıyla ilgili genlerin iyi bir şekilde kontrol edilmesi gerekir. Farklı stres koşullarında NTH1 geninin transkripsiyonun aktive olduğu ve bu aktivasyonun gerçekleşmesi içinde NTH1 geninin promotor bölgesinde bulunan Stress Response Element (STRE) olarak adlandırılan nükleotid dizilerinin gerekli olduğu bilinmektedir. Transkripyonel represör aktivitesi olan Nrg1 proteini farklı streslere karşı oluşturulan cevaplarda ve karbon stresinde görev alan genlerin regülasyonunda görev almaktadır. Nrg1 proteininin STRE ve PDS elementlerine bağlanabildiği bilinmektedir. NTH1 geninin promotor bölgesinde 3 adet olası Nrg1p bağlanma bölgesi bulunmaktadır. Bu nedenle bu tez araştırmasında Nrg1 transkripsiyon faktörünün NTH1 gen ekspresyonunun regülasyonundaki rolü incelendi. Yapılan biyoinformatik çalışmalarla Nrg1 proteininin NTH1 promotorunda bulunan STRE elementlerine yaklaştığı gözlemlendi. Çalışmada SUC2-LacZ ve NTH1-LacZ gen füzyonu içeren plazmidler, çoğaltılıp saflaştırıldıktan sonra yaban tip ve Δnrg1 mutasyonu bulunduran S. cerevisiae maya suşlarına transfer edildi. Azot stresi koşullarında NTH1 gen ekspresyonunun arttığı bilinmektedir. Bu nedenle farklı azot kaynaklarında üretilen transformant S. cerevisiae maya hücrelerinden örnekler alınarak, NTH1 gen aktivasyonu ve biriktirilen trehaloz miktarı enzimatik yöntemle belirlendi. Araştırmada Nrg1 proteinin normal şartlarda NTH1 transkripsiyonunun baskılanması için gerekli olduğu bulundu.

Trehalose, an unreduced disaccharide, is deposited by Saccharomyces cerevisiae under normal conditions as energy reserve. It is known that the amount of intracellular trehalose increases in response to environmental stress. When stress conditions ended, accumulated trehalose rapidly degrades to glucose. Synthesis of the trehalose is effected by the TPS enzyme complex, whereas degradation is effected by the neutral trehalase enzyme and the amount of trehalose in the cell is maintained at a certain level. Under different stress conditions, it is known that the transcription of the NTH1 gene is active and the nucleotide sequences, called Stress Response Element (STRE), are required for this activation. It is known that Nrg1 protein can bind to STRE and PDS elements. There are 3 possible Nrg1p binding sites in the promoter region of the NTH1 gene. Therefore, in this thesis, the role of the Nrg1p in the regulation of NTH1 expression was examined. The bioinformatics studies showed that the Nrg1p approached to the STRE elements in the NTH1 promoter. In this study, after amplification of plasmids containing the NTH1-LacZ and SUC2-LacZ gene fusions were transferred into wild-type and Δnrg1 S. cerevisiae yeast strains. It is known that expression of NTH1 is increased under nitrogen stress conditions. Therefore, the NTH1 activation and the amount of trehalose accumulated were determined by enzymatic methods using samples from transformant S. cerevisiae yeast cells produced in different nitrogen sources. In this study, it was found that Nrg1p is required for suppression of NTH1 transcription under normal conditions.