Metforminin, sıçanlardan elde edilmiş ve lipopolisakkarid ile indüklenen monositlerde TNF-? salınımına etkileri

Abstract

İmmün sistem yanıtının bir sonucu olan inflamasyon, pek çok hastalıkta ortaya çıkan bir tablodur (ateroskleroz, hipertansiyon, diyabet, kanser, romatoid artrit gibi). Diyabet tedavisinde kullanılan metforminin, kan şekerini düzenleyici etkisinden bağımsız olarak, antiinflamatuvar etkisininde olduğu bulunmuştur. Ancak etki mekanizması tam olarak açıklanamamıştır. Bu çalışmada, metforminin, lipopolisakkarid (LPS) ile inkübe edilmiş sıçan monositlerinden proinflamatuvar sitokinler olan TNF-? ve IL-6 sentez ve salınımı üzerindeki etkisi araştırıldı.Erkek 8-12 haftalık sağlıklı sıçanlardan (n=5, 200-250 g), genel anestezi (Xylazin 3 mg/kg + Ketamin 90 mg/kg) altında kardiyak puncture yöntemiyle 5 ml kan alındı ve steril EDTA'lı tüplere konuldu. Santrifuj (ficoll 3ml, 400xg, 30dk) yardımıyla mononükleer hücreler ayrıştırıldı. Hücreler RPMI 1640 media ile sulandırıldı (3.3±0.2x105/ml). Hücreler önce metformin (2.5 µM, 25 µM, 250 µM) ile 2,5 saat inkübe edildi. Bu sürenin sonunda LPS (100 ng/ml, 1µg/ml) eklenerek 5 saat daha inkübe edildi. Daha sonra santrifuj (400xg, 20dk.) yapıldı, süpernatantlar -80oC'de, ELISA yöntemi ile TNF-? ve IL-6 düzeyleri ölçülene kadar saklandı.Hücrelerin deneyler sonunda canlılık oranları %98'in üzerindeydi. TNF-? miktarları arasındaki fark, LPS 100 ng/ml ile, LPS + metformin (2.5µM, 25µM, 250µM) grupları karşılaştırıldığında (2179±359 ve 1613±437, 2915±572, 6059±948 pg/ml), istatistiksel olarak anlamlı bulunmadı (p>0.05). LPS 1µgr/ml ile, LPS+metformin (2,5µM, 25µM, 250µM) grupları karşılaştırıldığında (1752±553 ve 3023±745, 2344±598, 6238±841 pg/ml), 2.5µM (p<0,05) ve 250µM (p<0.05) metformin TNF-? değerlerini anlamlı şekilde artırırken, 25µM metformin anlamlı bir fark oluşturmadı (p>0.05). IL-6 miktarları ELİSA yöntemi ile ölçülecek miktarda bulunmadı.Bu konuda yapılan diğer çalışmalardan elde edilen sonuçlara göre, metforminin proinflamatuvar sitokinlerin sentezini inhibe etttiği bulunmuştur. Bu çalışmada, metformin, LPS ile indüklenen sıçan mononükleer hücrelerinden, TNF-? sentez ve salınımını, azaltmaktan ziyade artırmaya yönelik bir etki gösterdi.Anahtar kelimeler: Metformin, sitokin, Lipopolisakkarid, inflamasyon, mononükleer sıçan hücresi

Inflammation which is a response of immune system is seen in many disorders such as atherosclerosis, hypertension, diabetes, cancer, rheumatoid arthritis. Metformin, an oral antidiabetic drug, has antiiflammatory effect apart from blood glucose regulatory effect. However, the mechanism of antiinflammatory effect is not clearly understood. In this study, the effect of metformin on the release of cytokines (TNF-? and IL-6) from LPS stimulated rat mononuclear blood cells was investigated.Blood samples (5ml) were taken from healthy, male, 8-12 weeks old rats (n=5, 200-250g) through cardiac puncture under general anesthesia (Xylazine 3 mg/kg + Ketamine 90 mg/kg) into sterile EDTA containing tubes. Mononuclear cells were separated by centrifugation (ficoll 3ml, 400xg, 30min.) and were resuspended in RPMI 1640 media (3.3±0.2x105/ml). Cells were then incubated with metformin (2.5 µM, 25 µM, 250 µM) for 2,5 hours followed by addition of LPS (100 ng/ml, 1µg/ml) for further 5 hours. Following centrifugation (400xg, 20min.), supernatants were kept at -80oC until the measurement of TNF-? and IL-6 by ELISA.Cells viability was over 98% at the end of experiments. In terms of the amount of TNF-?, the difference of between LPS (100ng/ml) alone and LPS+metformin (2.5 µM, 25 µM, 250 µM) groups was not statistically different (2179±359 ve 1613±437, 2915±572, 6059±948 pg/ml) respectively, p>0.05. When we compared the difference between LPS (1µg/ml) alone and LPS+metformin (2.5 µM, 25 µM, 250 µM) groups (1752±553 ve 3023±745, 2344±598, 6238±841 pg/ml) respectively, 2.5µM (p<0,05) ve 250µM (p<0.05) metformin increased the amount of TNF-? statistically whereas 25µM (p>0.05) metformin did not. The amount of IL-6 was not within measurable range in this study.Metformin inhibited the synthesis of proinflammatory cytokines from monocytes isolated from mice and from human vascular smooth muscle cells, macrophages and endothelial cells induced with IL- 1ß. In this study, metformin increased the amount of released TNF-? rather than decrease.Key words: Metformin, cytokine, LPS, inflammation, mononuclear rat cells