Leishmania türlerinin in vitro kültivasyonu ve izolasyonunda yeni besiyerlerinin araştırılması

Abstract

Ill ÖZET Çalışmamızda Leishmania promastigotlarını bol olarak elde edilebilecek, canlılığını uzun süre sürdürebilecek, mikrobiyoloji ve parazitoloji laboratuvarlarında kolaylıkla bulunabilecek maddeler kullanılarak kan, fecal sığır serumu (FSS) ve eritrosit lizatının kullanılmadığı, hazırlaması kolay ve ucuz olan, Leishmania promastigotlarının kültürünün yapılabileceği besiyerlerinin hazırlanması amaçlanmıştır. Ayrıca besiyerlerine kutanöz leishmaniasis (KL) şüpheli hastalardan alınan biyopsi materyali ekilerek tanıdaki değeri araştırılmıştır. Bu amaçla protein kaynağı olarak triptikoz, sığır ekstresi ve maya ekstresi, karbonhidrat kaynağı olarak glukoz, otoklavlamadan önce FeNH4 ve sığır hemoglobini eklenerek Triptikoz Sığır ekstresi Hemoglobin (TBH) besiyeri, daha önceki çalışmalarımızda başarılı sonuçlar aldığımız P-Y ve Beyin Kalp besiyerine sığır hemoglobini eklenerek Pepton Maya ekstresi Hemoglobin (PYH) ve Beyin Kalp Hemoglobin (BKH) besiyerleri denenmiştir. Kontrol gurubu olarak RPMI 1640 besiyerine % 10 FSS ilave edilerek kullanılmıştır. Her besiyerine 1X1 05 promastigot olacak şekilde ekilmiştir. L. infantum promastigotlarının ekildiği RPMI 1640 ve BKH besiyerinde üreme en fazla 8 ile 13. günlerde, TBH ve PYH besiyerinde 16 ile 19. günlerde olmuş, 20. günden sonra TBH besiyerinde sayının daha yüksek olduğu saptanmıştır. L tropica promastigotlarının ekildiği besiyerlerinde ise 5 ile 20. günler arasında BKH, TBH ve RPMI besiyerlerinde promastigot sayısı birbirlerine yakın, PYH besiyerinde düşük olduğu görülmüştür. KL şüpheli 10 hastanın lezyonundan alınan sıvının besiyerlerine yapılan ekimleri sonucunda RPMI-1640 + %10 FSS besiyerinden 9 tanesinde, TBH besiyerinden 7 tanesinde, BKH besiyerinden 6 tanesinde, PYH besiyerinden ise 4 tanesinde üreme saptanmıştır. Besiyerleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark saptanmamıştır. İçinde FSS veya eritrosit lizatı bulunmayan, koiay hazırlanan ucuz, otoklavlanabilen 3 yeni sıvı besiyeri promastigotların üremesinde yeterli bulunmuş, hastadan izolasyonda saha çalışmalarında kullanılabileceği saptanmıştır.

IV SUMMARY The aim of this study was to establish novel culture media for leishmania spp, with a potantial of obtaining hight amounts of promastigotes with long-term viability, and consisting of ingredients that were available in wery microbiology or parasitology laboratory. Other features of these media included no requirement for blood, FCS (Fetal calf serum) or erythrocyte lysate, inexpensiveness and easiness in preparation. In addition, biopsy specimens, obtained from cutaneous leishmaniasis (CL)-suspected patients, were cultivated in these media to assess their diagnostic value. Three culture media were prepared; trypticase beef extract hemoglobine (TBH) medium, including trypticase, beef extract and yeast extract as the protein source, glucose as the carbohydrate source, FeNH4 and bovine hemoglobine; Peptone-Yeast extract medium, found to be effective in our previous studies on leishmania culture, with bovine hemoglobine (PYH) and Brain Heart medium, containing bovine hemoglobine (BKH). RPMI-1640 medium including 10% FCS was assessed as the control group. 1x105 promastigotes were added in each medium. Among the Leishmania i 'nfantu m -inoculated media, reproduction was highest on day 8 and 13 in RPMI 1640 and BKH medium, respectively. In TBH and PYH, the peak level of reproduction was between day 16 and 19, and it was found to be higher in TBH medium after the day 20. Among the Leishmania frop/ca-inoculated media, the number of promastigotes were found to be close in BKH, TBH and RPMI-1640 media and lower in PYH medium. Examination of the cultivation of the aqueous lesion specimens of the 10 CL- suspected cases in media revealed reproduction in 9 flasks of RPMI-1640 containing 10% FCS, 7 TBH, 6 BKH and 4 PYH. The differences between the culture media were not found to be statistically significant. These results suggested that, three liquid culture media, assessed in this study, with no requirement for FCS or erythrocyte lysate, were effective in the reproduction of promastigotes, and could be used effectively in the patient isolation and field studies, as well.