Farklı ovulasyon indüksiyonu protokolleri uygulamalarının sıçan over dokusunda follikül gelişimi üzerine etkilerinin immunohistokimyasal yöntemle ve ince yapı düzeyinde değerlendirilmesi

Abstract

Yardımcı Üreme Teknikleri uygulamalarında, sağlıklı gebelik elde edebilmenin yüksek oranlara ulaşmasında, normal over döngüsü ve ovulasyon indüksiyonu protokollerinin over dokusunda moleküler düzeydeki etkilerinin araştırılması önemlidir. Çalışmada, normal over döngüsü ile rekombinant follikül stimüle edici hormon (rFSH) ve klomifen sitrat (KS) uygulamalarının sıçan over dokusunda kemik morfojenik proteinlerin (BMP), siklin bağımlı kinaz (cdc), konneksin (Cx) ve mitojen aktive edici protein kinaz (MAPK) dağılımlarına etkisinin immunohistokimyasal olarak ve bu dönemlerde folliküller gelişmede over dokusunda oosit ve granuloza hücrelerinin ince yapı düzeyinde, transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak değerlendirilmesi amaçlanmıştır.Çalışmada erişkin dişi Wistar albino sıçanlar (230-280 gr), proöstroz, östroz, diöstroz, rFSH (10 İÜ, sc), KS (4mg, oral) (n: 7, herbiri) olarak 5 grupta değerlendirildi. Gruplar vajinal yayma preperatlarının Giemsa boyaması ile incelemesiyle belirlendi ve kan FSH değerleri ölçüldü. İlaç uygulamaları östroz grupta bulunan sıçanlara uygulandı. Genel anestezi uygulanan deney hayvanlarından elde edilen over doku örnekleri, ışık mikroskobik değerlendirme için %10 formalinle tespit edilerek rutin parafin doku protokolüne göre takip edildi. Elektron mikroskobik değerlendirme için doku örnekleri % 2,5'luk gluteraldehit ve takiben % 1 osmiyum tetroksit ile tespit edilerek rutin elektron mikroskop protokolüne göre takip edilerek araldit karışımına gömüldü.Parafin bloklardan alınan 5 µm. kesitler Hematoksilen Eozin'le (H.E) boyanarak, gruplarda follikül değerlendirmesi ve sayımı yapıldı. Ek kesitler anti-BMP-4, anti-BMP-6, anti-P34cdc2, anti-Cx43 ve anti-P38MAPK primer antikorlarıyla avidin-biyotin-peroksidaz yöntemi ile indirek immunohistokimyasal olarak değerlendirildi. İmmunoreaktivite şiddeti hafif, orta, şiddetli olarak belirlendi. Tüm sonuçlar, ANOVA istatistik testiyle karşılaştırmalı olarak değerlendirildi.Araldit bloklardan alınan 1 µm. yarı ince kesitler, toluidin mavisi ile boyanarak, gruplarda follikül değerlendirilmesi yapıldı. 140 nmlik ince kesitler, uranil asetat- kurşun sitrat ile kontrastlama yapılarak ZEISS elektron mikroskobunda değerlendirildi.FSH değerleri vajinal yayma sonuçları ile uyumlu olarak bulundu. H.E. boyalı preparatlarda proöstroz grupta çoğunlukla gelişmekte olan folliküller, östroz grupta Graff follikülleri ve diöstroz grupta sekonder follikül ile korpus luteum yapıları izlendi. rFSH grubunda daha fazla olmakla birlikte indüksiyon yapılan gruplarda artmış gelişen ve Graff follikül yapıları gözlendi. MAPK, Cx43, p34cdc2 immunoreaktiviteleri oosit, granüloza, teka hücrelerinde; BMP-6 oosit ve granüloza hücrelerinde; BMP-4 teka hücreleri, stromal hücreler ve germinal epitelde pozitif olarak değerlendirildi. Moleküller proöstroz dönemde hafif/orta, östroz dönemde orta/şiddetli, diöstroz grupta hafif/orta olarak değerlendirilirken, rFSH grubunda şiddetli, KS grubunda orta/şiddetli olarak değerlendirildi.Yarı ince kesiti alınan proöstroz grubunda gelişmekte olan folliküller, östroz grubunda Graff follikülü ve diöstroz grubunda korpus luteum ve sekonder follikül yapıları izlenirken, rFSH ve KS grubunda sekonder follikül ve Graff follikül yapıları değerlendirildi. İnce kesitlerde, oosit sitoplazmasında lipid damlacıkları, mitokondriyonlar; oosite ait mikrovillusların ve kumulus granuloza hücre çıkıntılarının zona pellusida içerisine yayıldığı gözlendi. Östroz, rFSH ve KS gruplarında oosit sitoplazması içinde lipid damlacıklarının ve mitokondriyonların arttığı izlenirken, diöstroz grubunda azaldığı izlendi.Normal over döngüsü süresince, FSH artışı; p38MAPK aracılığıyla oositte cAMP ve BMP-6 artışına neden olmakta ve p34cdc2 ile konneksin 43 etkileşimi sonucu ovulasyon süreci düzenlenmektedir. BMP-4 ve -6, FSH'a bağlı olarak progesteron sentezini inhibe ederek, granuloza hücrelerinin luteinizasyon sürecinde rol oynamaktadır. P38MAPK ise östradiol sentezini arttırmakta ve granuloza hücrelerinin hücre içi değişikliklerini ve yaşamını etkilemektedir. Çalışmada, uygulanan dozlarda rFSH ve KS kullanılması ile sıçan over dokusunda çok sayıda follikül gelişmeye başladığı ve rFSH'da daha fazla olmak üzere moleküllerin artarak birbirleri ile etkileşimleri yoluyla, follikül gelişimi ve oositlerin olgunlaşma sürecinde düzenleyici yönde etkili oldukları düşünülmüştür.

The investigation of the effects of normal ovarian cycle and ovulation induction protocols in ovarian tissue on molecular level is important for to increase the chance of healthy pregnancies in Assisted Reproductive Techniques applications. It was aimed to evaluate the changes of ovarian tissue in rats with normal ovarian cycle which administered recombinant follicle stimulating hormone (rFSH) and clomiphene citrate (CC) and controls in the present study by determining the distribution of bone morphogenic proteins (BMP), cyclin dependent kinase (cdc), connexin (Cx), mitogen activated protein kinase (MAPK) using immunohistochemistry and ultrastructure of oocytes and granulosa cells during follicular development in ovary tissue using transmission electron microscope.Wistar Albino female rats, 230-280 gr., (n: 7, each) were divided into five groups as: proestrous, estrous, diestrous, rFSH (10 IU, sc), CC (4 mg, orally). Groups were determined according to Giemsa stained vaginal smear results and confirmed with blood FSH levels. Drugs were administered to the rats during estrous cycle. Under general anesthesia, for light microscopic evaluation, ovarian tissues were obtained and were fixed in 10% formalin solution and routine paraffin tissue procedure were executed. For electron microscopic evaluation, tissue samples were fixed in 2,5 % gluteraldehyde and then 1% osmium tetroxide solutions and routine electron microscopy procedure were executed and were embedded in araldite mixture.Five µm sections taken from paraffin blocks were stained with Hematoxylin-Eosin (H.E.) and follicle evaluation was done and the numbers of follicles were counted in the groups. Sections were stained immunohistochemically using anti-BMP-4, anti-BMP-6, anti-P34cdc2, anti-Cx43 and anti-P38MAPK primary antibodies using avidin-biotin-peroxidase technique. Immunoreactivities were scored as mild, moderate or severe and results were evaluated comparatively using ANOVA statistical test.One µm semithin sections taken from araldite blocks were prepared for staining using toluidine blue and was evaluated follicle structure evaluation was done in groups. One hundred forty nm thin sections were prepared and contrasted using uranyl acetate-lead citrate and were evaluated using ZEISS transmission electron microscopy.FSH results were consistent with vaginal smears. In evaluation of H.E. stained samples, dominantly growing follicles were seen in proestrus group, Graffian follicles in estrous group and corpus luteum in diestrous group. There was an increase in the number of growing and Graffian follicles in rFSH, dominantly, and CC groups. Immunoreactivities of MAPK, Cx43, p34cdc2 were observed in oocyte, granulose and theca cells. Immunoreactivity of BMP-6 was observed in oocyte, granulosa cells, while BMP-4 was detected in theca, stromal cells and germinal epithelium of ovary. These molecules were observed as mild/moderate in proestrous group, moderate/severe in estrous group, mild/moderate in diestrous group, severe in rFSH and moderate/severe in CC groups.In evaluation of semithin sections, growing follicles were seen in proestrus group, Graffian follicles in estrous group and corpus luteum and secondary follicles in diestrous group. Increased Graffian follicles were seen in rFSH and CC groups. In evaluation of uranyl acetat-lead citrate contrasted thin sections, lipid droplets and mitochondri were seen in the cytoplasm of oocyte and microvilli and trans zonal processes were observed within zona pellusida in all groups. While the lipid droplets and mitochondri were increased in the cytoplasms of oocytes in the estrous, rFSH and CC groups; decreased in the diestrous group.During the normal ovarian cycle, the increase of the level of FSH increases the cAMP and BMP-6 in oocytes by means of P38MAPK and ovulation process is regulated by their interactions with p34cdc2 and Cx43. BMP-4 and BMP-6 play a role in the luteinisation process of granulosa cells with inhibiting FSH-dependent progesterone syntesis. P38MAPK increases estradiol synthesis and effects the intercellular changes and survival of granulosa cells.It was observed that application of rFSH, CC caused increase in number of growing follicles in rat ovary and it was though that it is important to reach full maturation of all oocyte for interaction with molecules.