Azospermi tanısı almış hastalardan alınan testiküler sperm ekstraksiyonu (TESE) örneklerinden elde edilen spermatogonial kök hücrelerin kültürü

Abstract

Azospermi, semen örneğinde hiç sperm görülmemesidir. Bu gibi vakalarda testiküler sperm ektrasiyonu (TESE) ile alınan örneklerde sperm taraması yapılır. Fakat TESE örneklerinde sperm gözlenemeyen olgularda yardımcı üreme teknikleri uygulanamamaktadır. Çalışmada sperm gözlenmeyen fakat spermatogonial hücrelerin olduğu TESE örneklerinden spermatogonial kök hücrelerin kültürü ve farklılaştırılması amaçlanmıştır.Ege Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Aile Planlaması ve Kısırlık Merkezine azospermi tanısı ile başvuran ve TESE sonrası sperm görülmeyen hastaların örnekleri (n=10) bir kısmı rutin parafin, diğer kısmı rutin elektron mikroskobik analiz için, kalanıda bir gece tripsin/EDTA solüsyonu içerisinde +40C'de inkübe edildi, jelatinli kültür kaplarında Ham'sF10 içerisinde 5 gün kültüre edilerek somatik hücrelerin yapışması sağlandı. Yüzen hücrelerin matrijel kaplı kültür kaplarında DHF12 vasatında 2 gün kültüründen sonra ortama 20?g/ml EGF ve 10?g/ml bFGF ilave edildi. Kültürün 1. ve 2. Haftalarında toplanan hücreler ile parafin kesit örneklerinde anti-?6 integrin, anti-ß1 integrin, anti-CD133, anti-CD90, anti-GPR125, anti-akrozin dağılımı indirekt immunoperoksidaz yöntemi ile incelendi. Kültüre edilen hücreler ayrıca elektron mikroskobik analiz yapıldı.Jelatin kaplı kültür ortamında somatik hücrelerin yapıştığı, matrijel kaplı ve farklılaşma vasatında hücrelerin epiteloid karakterde germ hücreleri olarak çoğaldığı izlendi. İmmunohistokimyasal analiz sonucunda, 1. haftada hücrelerin akrozin ve ß1integrin immunoreaktivitelerinin zayıf, ?6 integrin orta, GPR125 ve CD133 ise tüm olgularda kuvvetli pozitif olduğu görüldü. Kültürün 2. Haftasında ise esas olarak akrozin ve ß1 integrin immunoreaktivitelerinin 1. haftaya göre daha fazla olduğu gözlendi. CD90 immunoreaktivitesinin tüm boyamalarda benzer idi. Ultrastruktürel olarak ise, kültürün 1. haftasındaki hücrelerin spermatogonia hücreleri ile mitotik özellik gösteren hücreler, 2. haftadaki kültür hücrelerinde ise elektron dense vezikül içeren (akrozomal özellik), yer yerde kromatin kondensasyonu gözlenen, spermatonegenetik seriye ait hücreler izlenmesi üzerine tüm veriler değerlendirildiğinde, farklılaşan hücrelerin sperm benzeri hücreler olabileceği düşünüldü.

In azoospermia patients, sperm look for after extraction of testicular sperm (TESE) samples. In ourstudy, culture and differentiation of spermatogonial stem cells after TESE were aimed in without sperm and with spermatogonium samples.The samples (n=10) were used the patients, who admitted with a diagnosis of azospermi and after TESE, the sperm was not detected, apply to Ege University Medical Faculty, Family Planning and Infertility Center, some of these samples were follwed by routine paraffin and some of others incubated with trypsin / EDTA solution in +40C for overnight, then incubated on gelatin-coated culture dishes in Ham's F10 for adhesion of somatic cell five days. After swimming cells culture in DHF12 medium for 2 days, 20?g/ml EGF and 10?g/ml bFGF were added to culture. Anti-?6 integrin, anti-ß1 integrin, anti-CD133, anti-CD90, anti-GPR125, anti-akrozin range investigated by indirect immunperoksidase method in the samples were collected in 1. and 2. week of culture and the paraffin sections. Also the cultered samples were analized with electron microscoby method.Fuziform shaped of somatic cells attached to gelatin-coated dishes can be observed, while the cells on the matrigel were epithelioid shape and they were proliferate 1. and 2. weeks of culture. After immunohistochemical analysis, in the first week of culture acrozin and ß1integrin immunoreactivities were slim, the immunoreactivity of ?6 integrin was moderate positive, the GRP125 and CD133 was strongly positive in all samples. In case in the second week samples acrosin and ß1integrin immunoreactivities were higher compare with the first week samples. CD90 immunoreactivities weren?t different first week and second week results. Ultrastructurally, we observed that the first week cells were spermatagonia cells and mitotic cells, the second week cells which that had electron dense vesicules and were spermatogenic series cells chromatin condensation observed in the places.