Sıçan testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarında, pı3k-akt-mtor yolakları üzerinden cape ve EGCG`nin koruyucu etkilerinin değerlendirilmesi

Abstract

Testis torsiyonu veya spermatik kordun torsiyonu özellikle çocuklarda ve genç erkeklerde görülen, çoğunlukla cerrahi işlem gerektiren ürolojik vakalar arasında yer almaktadır. Erken tanı konulup testisin korunduğu vakalar dahil olmak üzere, erkek infertilitesinde gözlenen en önemli nedenlerden biridir. Testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarı üzerine yapılan çalışmalarda, koruyucu olarak birçok antioksidan çeşitli vitamin ve ilaç kullanılmıştır.Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) yeşil çayın % 80'ini oluşturan flavonoidler arasında yer almaktadır. Yeşil çayda yer alan EGCG ile, testiküler androjen üretimindeki sinyalizasyon yolakları olan protein kinaz A (PKA) ve protein kinaz C'nin (PKC) ilişkili olduğu, ancak hangi yolağı takiben testesteron üretimi yaptığı yada testis üzerindeki koruyucu işlevi olduğu bilinmemektedir.Caffeic acid phenethyl ester (CAPE-Propolis) ise flavonoidlere benzeyen bal arısı propolisinin aktif bir bileşenidir.CAPE'nin antioksidan, antienflamatuvar, antiviral ve immünomodülatör olduğu gösterilmiştir.mTOR (mammalian target of rapamycin), birçok kritik hücre içi olayları düzenleyen temel kinaz enzimlerinden biridir . mTOR, serin-threonin kinaz ailesinden PI3K/AKT/mTOR sinyal yolağına dahildir. mTOR hücre büyümesi, hücre çoğalması, protein sentezi ve transkripsiyonu, anjiyogenez, apoptoz ve otofajiyi etkilemektedirBu çalışmada, genç erişkin Wistar Albino sıçanlarda testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon sonrası oluşan doku hasarında, P13K-Akt-mTOR sinyal ileti yolaklarının öneminin ve antioksidan ajanlar arasında yer alan Epigallocatechin-3-gallate (EGCG) ve Caffeic acid phenethyl ester (CAPE)'in testis hasarı üzerindeki koruyucu etkilerinin biyokimyasal, histopatolojik ve immunohistokimyasal olarak değerlendirilmesi planlanmıştır. Biyokimyasal kan analizlerinde MDA, Katalaz ve 8-OHG düzeyleri ölçülerek değerlendirilecektir. Histopatolojik olarak testiste seminifer tübülüsü oluşturan spermatogenez sürecindeki tüm hücrelerin ve Sertoli hücreleri ile interstisyel Leydig hücrelerinin morfolojik olarak Johnson's skorlaması ile değerlendirilmesi yapılacaktır. Histopatolojik inceleme ile, iskemi/reperfüzyon hasarında EGCG ve CAPE uygulamalarının koruyucu etkileri olup olmadığı ışık mikroskop altında değerlendirilmiş olacaktır. DNA hasarı TUNEL yöntemi kullanılarak değerlendirilecektir. TUNEL pozitif boyanan hücreler % olarak belirlenerek, sonuçlar gruplar arasında karşılaştırmalı olarak ANOVA istatistik testi ile değerlendirilecekltir. İmmünohistokimyasal olarak PI3K-Akt-MTOR yolağında yer alan primer antikorları ile, apoptotik süreçte ekstrensek ve intrensek yolakların etkilenmelerini göstermek amacı ile Caspas 8 ve Caspas 9 primer antkorları ile indirek immunohistokimyasal yöntemle değerlendirme yapılacaktır. İmmunohistokimya boyanma skorları, yarı-kantitatif yöntemle hafif (1), orta (2), şiddetli (3) ve çok şiddetli (4) olarak belirlenerek h-Skor hesaplanacaktır. Toplam boyanan hücre sayıları belirlenerek (boyanma yoğunluğu +1) ile çarpılarak belirlenen h-skor'lar gruplar arasında ANOVA istatistik testi ile karşılaştırmalı olarak değerlendirilecektir. Bu çalışma sonunda, EGCG ve CAPE'in infertilite nedenlerinden biri olan testis torsiyonu iskemi/reperfüzyon hasarı üzerine etkileri moleküler düzeyde değerlendirilmiş olacaktır. Tedavinin koruyucu etkileri izlenerek, antioksidanların tek tek ya da birlikte kullanıldıklarında sinerjik etkilerinin önemi ortaya konulacaktır

Testicular torsion or spermatic cord torsion ,especially seen in children and young men, ends up needing a surgical intervention. among urological cases. It is one of the most important reasons why men infertility has to be observed and early diagnosis can protect the testis from irreversible damage. In the studies about torsion/ reperfusion damage,there is a wide variety of vitamins,medicines and antioxidant that are used for protective measures. EGCG takes place in flavanoids, which form eighty percent of green tea. It is known that EGCG in green tea is related with PKA and PKC which are signalization patways in testicular androjen production, known to produces testesterone. Cape propolis is an active component of honey bee. CAPE propolis which is similar to flavanoids has been shown to have antioxidant ,anti-inflammatory, antiviral immüne-modulator effects. mTOR is one of the basic kinase enzymes, which coordinates many critical cell functions. mTOR is a member of PI3K/AKT/mTOR signal patways, from the serin-threonin kinase family. mTOR effects cell growth, cell proliferation ,synthesis and transcription of proteins, angiogenesis, apoptosis and autophagy. In this study our aim is to evaluate the importance of PI3K /AKT/mTOR signal message ways and protection effects of EGCG and CAPE, which occur among antioxidant agents biologically on testis damage. Structure damage which occurring after reperfizyon in young adult Wistar Albino rats will evaluate using indirect Immunocytochemstry method. Histopatological examination will be done using Johnson's score and all cells which included in the process of spermatogenesis and seminifer tubulus, Sertoli cells and interstitial Leydig cells will be analysed.In biochemical blood analysis,will be evaluated by measuring levels of MDA,Katalaz,8-OHG. It will be investigated whether appliance of EGCG and CAPE have protective effects on testis torsion/reperfusion damage or not by histopatological evalution under the microscope. DNA damage will be defined by using the TUNEL method. Defining colored positive cells as percentage, results will be evaluated using the ANOVA statistical test, relatively among groups. Evaluation will be made by an indirect immunohistochemical method with the aim of showing the effects of extrinsic and intrinsic ways in the apoptatic process with primer antibodies which take place in PI3K/ AKT/ mTOR signal pathways immunocytochemstry wise,with Caspes 8 and Caspes 9. H-score will be calculated by defining immunochemstry coloring scores as mild (1),moderate(2),strong(3),very strong(4). The results will be evoluated relatively using the ANOVA statistic test by defining the total cell numbers mulptiplying among h-scores groups. At the end of this study, we will be evaluated the effects of EGCG and CAPE on testis torsion damage which is one of the reasons of infertility at a molecular level. The importance of synergic effects will be stated by observing the protective effects of treatment, when antioxidants are used one by one or all together.