Trofoblastik hücre ürünlerinin oosit kültüründeki yeri

Abstract

Amaç: Çalışmamızda elde edilecek trofoblastik hücre ürünlerinin oosit kültüründe kullanılması ve oosit matürasyonuna olası etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır.Gereç ve Yöntem: Çalışmamızda 14,5 günlük gebe farelerden enzimatik işlem sonucunda trofoblast kök hücreleri elde edildi. Ardından kültür işlemi için profaz I, metafaz I ve metafaz II oositler dişi farelerden elde edilerek M2 kültür vasatı, trofoblast kök hücre kültür vasatı (CM) ve trofoblast kök hücreleri (TR) ile 48 saat kültüre edildikten sonra her gruptan oositler immunoflouresan boyama ile anti-APC, anti-MAD1, anti-MAD2, anti-RAS, anti-MPF ve anti-Siklin B1 immunoreaktivitesinin tespiti ve DNA metilasyon analizi için ayrıldı. Bulgular: Trofoblast kök hücreleri plasentadan elde edilerek sitokeratin-7 pozitif olmasıyla karakterizasyonu yapıldı. Profaz I, metafaz I ve metafaz II aşamalarında toplanan oositlerin M2, CM ve TR kültür ortamında kültürleri sonrasında APC immün reaktivitesinin en fazla TR profaz I grubunda, MAD1 immünoreaktivitesinin TR grubunda metafaz II'de olduğu ve diğer gruplarda daha erken dönemde pozitiflik gösterdiği saptandı. MAD2 immunreaktivitesi ise en fazla CM grubunda, RAS immunoreaktivitesi en az TR grubunda iken diğer gruplarda beklenen şekilde idi. Siklin B1 immünreaktivitesi tüm gruplarda az iken MPF immünoreaktivitesinin özellikle CM grubundaki tüm oositlerde ve M2 grubundaki metafaz II oositlerde olduğu saptandı. DNA metilasyonunun en fazla M2 metafaz II oositlerde olduğu bunu CM grubundaki metafaz II oositin takip ettiği gözlendi. Sonuçlar: Çalışmada ana bilim dalımızda plasentadan ilk defa trofoblast kök hücre eldesi protokolü geliştirilmiş ve karekterizasyonu yapılmıştır. Elde edilen oositlerin kültürleri sonrasında CM kültür vasatının RAS, MPF ve MAD2 ekspresyonlarındaki artışa, APC ve siklin B1 ekspresyonundaki azalmaya sebep olmasından dolayı in vitro oosit maturasyonu kültürü açısından uygun olabileceği sonucuna varıldı.

Aim: In this study we aimed to investigate the role of trophoblastic items on oocyte maturation and oocyte arrest.Material methods: Trophoblast stem cells isolated from 14,5 days mouse embriyo plasentas. Prophase I, metaphase I and metaphase II oocytes collected from mice and cultured in M2 culturing media, trofoblast stem cells culturing media (CM) and with trofoblast stem cells for 48 hours. Then the oocytes were seperated into two main groups for whole mount immunohistochemistry, that we anaylsed the immuno reactivity of anti-APC, anti- MAD1, anti-MAD2, anti-RAS, anti-MPF and anti-cyclin B-1, and also for DNA methylation analyses. Results: Trophoblast stem cells were cultured and characterised with cytokeratin 7. After culturing prophase I, metaphase I and metaphase II oocytes in M2, CM, TR medium APC immunoreavtivity was highest in TR prophase I. MAD1 immunoreactivity was only detected in TR metaphase II whereas the other groups was positive at the earlier stages. Although MAD2 immunoreactivity was higher in CM group RAS immunoreactivity was minimum in TR group and the other groups showed the immunoreactivity as they were expected. The immunoreactivity of cyclin B1 was weak in all groups however MPF immunoreactivity detected in all oocytes of CM and metaphase II of M2. While the low level of DNA methylation was detected at CM metaphase II oocytes, the highest ratio was observed in M2 metaphase II oocytes. Discussion: The protocol of trophoblast stem cells derivation was obtained for the first time in our department and characterised. Because of increase of RAS, MPF and MAD2 immunoreactivity and decrease of APC and Cyclin B1 after culturing of oocytes in CM, this culture conditionmight support the in vitro oocyte maturation.