Kök hücre uygulamasının deneysel testis torsiyonunda oksidatif stres parametrelerine etkilerinin histolojik ve biyokimyasal açıdan karşılaştırılması

Abstract

Amaç: Testis hasarı günümüzde önemli bir fertilizasyon problemi olup güncel ve insan çalışmaları başlamış olan kök hücre tedavisi geleceğin klinik uygulaması olabilecek potansiyeldedir. Testis hasarında kök hücre uygulaması yapılmakla birlikte tekrarlayan sistemik kök hücre uygulaması ve testisteki histopatolojik bulguların serumda biyokimyasal parametreler ile ilişkisi bilnmemektedir. Bu nedenle çalışmamızda deneysel testis torsiyonu (DTT) oluşturulmuş sıçanlarda yağ doku kökenli kök hücre (YKH) ile nişi olan besiyeri (BY) uygulamaları sonrası testis dokusu ve kandaki oksidatif stres parametrelerinin biyokimyasal ve histolojik açıdan karşılaştırılması amaçlandı.Gereç ve Yöntem: Çalışmada 30 adet, ağırlıkları 250 ± 50 arasında değişen yetişkin Wistar erkek sıçanlar kullanıldı. Deney hayvanları kontrol grubu (KG, n:5), torsiyon grubu (TG, n:5), torsiyon rete testis besiyeri grubu (TRTBYG, n:5), torsiyon rete testis yağ kök hücre grubu (TRTYKHG, n:5), torsiyon inraperitonel besiyeri grubu (TİPBYG, n:5), torsiyon inraperitonel yağ kök hücre grubu (TİPYKHG, n:5) olmak üzere 6 gruba ayrıldı. KG'na hiçbir uygulama yapılmadı. TG'na 2 saatlik torsiyon sonrası reperfüzyon yapıldı ve testisler kapatıldı. TRTBYG'na torsiyon ve reperfüzyon sonrası rete testisten tek doz 100 µl besiyeri verildi. TRTYKHG'na torsiyon ve reperfüzyon sonrası rete testisten tek doz 1x106 YKH /100 µl BY içinde verildi. TİPBYG'na torsiyon ve reperfüzyon sonrası intraperitonel olarak 7 gün boyunca 500 µl besiyeri verildi. TİPYKHG'na torsiyon ve reperfüzyon sonrası intraperitonel olarak 7 gün boyunca 1x106 YKH /500 µl BY içinde verildi. Tüm deney grupları uygulama sonrası 7. günde sakrifiye edilerek, testislerin yarısı histolojik incelemeler için, diğer yarısı ve kan örnekleri biyokimyasal analizler için alındı. Alınan testis örnekleri histopatolojik değerlendirme için hematoksilen-eozin ile, eNOS, iNOS ve kaspaz-9 antikorları immünohistokimyasal ile, apoptoz incelemesi TUNEL boyaması yapılarak ışık mikroskopta değerlendirmeleri yapıldı. Testislerin diğer yarısı ve kan serumlarında oksidatif stres için melondialdehit (MDA), glutatyon peroksidaz (Gpx), süperoksit dismutaz (SOD), nitrik oksit (NO), katalaz ve 8-hidroksi-2'- deoksiguanozin (8-OHdG) biyokimyasal olarak bakıldı. Sonuçlar One-Way ANOVA istatistik analizi ile değerlendirildi. Bulgular: TG testis hasarında testislerde nekrotik yapılar, seminifer tübüller arasında ödem ve boşluklar, seminifer tübüllerin içerisinde spermatogonial hücre serisinin kaybı, atrofik yapılar, piknotik hücreler gözlemlendi. TRTYKHG iyileşme gözlemlenirken, TİPYKHG'de iyileşmenin daha iyi olduğu saptandı. Diğer gruplarda da hasarda iyileşme gözlende de en iyi etki lokaldeki uygulamaya sistemik yolla verilen destek ile elde edildi. Oksidatif sters için bakılan eNOS ve iNOS boyamalarında hasarda görülen anlamlı artışın histopatolojik düzelmedeki bulgulara paralel bir biçimde azaldığı bulundu. Oksidatif stres ile paralel bir biçimde TG sonrası reperfüzyon hasarı artan kaspaz-9 ve TUNEL immünoreaktiviteleri ile apoptotik ölüm kök hücre ve besiyeri uygulamalarında anlamlı bir şekilde azaldı. Diğer gruplarda da yararlı etki görüldü. Ancak tedavi etkisi açısından bakıldığında Bu açıdan da lokalde uygulanan tedavi sistemikle en iyi etkiyi verdi. Testis dokusu ve serumda bakılan biyokimyasal parametrelerden MDA, NO, 8-OHdG TG için artış gösterirken kök hücre tedavisi ile azaldığı; oksidatif stres oluşumunda koruyucu olan SOD, Gpx, katalaz enzimlerinin TG için azalırken kök hücre ve niş tedavisi ile artışına destek sağlandığı saptandı. Bu açıdan da lokal uygulamaya sistemik olarak verilen desteğin en belirgin düzelmeyi oluşturduğu saptandı.Sonuçlar: Torsiyon infertilitede önemli bir problemdir ve tedavisi etkinliğini arttırmak için yeni yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kök hücre tedavileri gün geçtikçe artan ve torsiyon tedavisinde potansiyeli olan bir üründür. Çalışmamızda YKH için bir ürün olarak etkin yararları saptanmış ve muhtemel bir zarar bulunmamıştır. Ayrıca TG testis dokusunda meydana gelen hasarın kanda oksidatif stres parametrelerine bakılarak fikir sahibi olunabileceği ortaya kondu. YKH için testis dokusunda oksidatif stres kaynaklı aktive olmuş mitokondriyal apoptozu geriletmiş olması infertilite ve Üremeye Yardımcı Tedavi Yöntemleri için önemli olabileceği saptandı. Bu sonuçlara göre kök hücre ve nişinin iskemik reperfüzyon hasarı kaynaklı infertilite vakalarında bir ürün olarak yararlı olabileceği düşünüldü.

Aim: Nowadays, testicular torsion is still continues to be an important fertilization problem and updated and human trials has been started for stem cell treatment with the potential of can be able to be a clinical application in the future. Stem cell application at testicular damage is performing still, but continuous systemic stem cell application and the correlation between testicular histopathological results and serum biochemical parameters is still unknown. Therefore, with this study, in the experimental testicular torsion formed rats, it has been aimed that after with the adipocyte derived stem cell (ADSC) with medium and niche application, comparison of biochemical and histologic parameters changes in the blood and testicular tissue have been aimed. Material and Method: In this study, 30 of the adult Winstar male rats that weighted between 250 ± 50 gram have been used. Animals are separated as 6 groups as control group (CR n:5), torsion group (TG, n,5), torsion rete testicle medium group (TRTMG, n:5) torsion rete testicle adipocyte derived stem cell group (TRTADSCG, n:5) torsion intraperitoneal medium group (TIMP n:5) torsion intraperitoneal adipocyte derived stem cell group (TIADSCG n:5). At CG, no application has been carried out. At TG, before 2 hours of torsion, reperfusion is made and testicles have been closed. To TRTMG, after the torsion and reperfusion, single dose of 100 µl culture medium have been applied at rete testicles. To TRTADSCG, after the torsion and reperfusion, single dose of 1x106 ASC have been applied with 100 µl CM at rete testicles. To TIPMG, after the torsion and reperfusion, 500 µl culture medium has been injected intraperitoneally at daily basis for 7 days. To TIPADSCG, after the torsion and reperfusion, 1x106 ADSC has been injected daily with 500 µl medium for 7 days. All experimental groups are sacrificed at post-operation after the 7 days, and half of the testicles are taken for histologic evaluation and other half has been sent to biochemical analyses together with the blood samples. Testicle samples which has been taken are stained with haematoxylene-eosin for histological evaluation, eNOS, iNOS and with caspase-9 immunohistochemiacal stains for immunohistochemiacal evaluation, TUNEL staining for apoptotic evaluation has been performed and slides are observed upon light microscope. Other half of the testicles and blood serums are evaluated biochemically for oxidative stress with melondialdehiyde (MDA), glutathione peroxidase (Gpx), superoxide dismutase (SOD), nitric oxide (NO), catalase and 8-hidroxy-2'- deoxiguanosine (8-OHdG). Results are evaluated in One-Way ANOVA statistical analysis.Results: In TG testicle damage, necrotic damage in testicles, edema and spaces between the seminiferous tubules, the loss of spermatogonial cell series in seminiferous tubules, atrophic structures and picnotic cells have been observed. At TRTADSCG, healing have been observed but it has been seen better in the TIPADSCG. At the other groups, healing from the damage also has been observed but best results have been obtained at systemic support to the local application. At the eNOS and iNOS staining for oxidative stress, meaning results that observed with the damage is decreased in parallel with the histological improvement. After TG, parallel with the oxidative stress, caspase-9 and TUNEL immunoreactivity with apoptotic death stem cell and culture medium application has been decreased meaningly. In the other groups, positive effects have been observed. But when looking for the healing capabilities, local therapy gives the better results compared with the systemic therapy. When biochemical parameters in the testicle tissue and serum are analyzed, MDA, NO, 8-OHdG are increased for TG group, meanwhile it is decreased with the stem cell therapy; oxidative stress protectants SOD, Gpx, catalase enzymes are decreased for TG, but improvement with the stem cell and niche therapy has been observed. When it's examined, it has been concluded that local application with the systemic support is gives the best results for improvement.Results: Tosion is an important problem for the infertility and for the improvement of the treatment, the demand for the new methods continue. Stem cell treatment studies increasing with the time and it have potential for the torsion treatment. In our study, for the ADSC, it has been proved that is beneficial for the treatment as a production and no possible harm detected. Also with the TG, it has been concluded that it is possible for the search of the testicular damage evaluation from the blood with the oxidative stress parameters. For the ADSC, in the testicular tissue, oxidative stress related and activated apoptosis is reversed and this can be both helpful and important for the assisted reproduction techniques. With this results, it has been considered that the stem cell and its niche can be helpful for the ischemic reperfusion damage related infertility cases as a production.