Polifenol oksidaz enziminin kerevizden (Apium graveolens L. ) kısmi saflaştırılması, karakterizasyonu ve bazı inhibitörlerin enzim aktivitesi üzerine etkilerinin incelenmesi

Abstract

VI ÖZET Polifenol oksidaz (PPO; monofenol dihidroksi-L-fenilalanin oksijen oksidoreduktaz, EC 1.14.18.1) filogenik sıkalada oldukça yaygın bulunan bir bakır enzimidir. Kereviz (Apium graveolens L) polifenol oksidazı (PPO) (NH4)2S04 çöktürmesi ve diyaliz ile izole edildi. Kereviz kökü ve yaprağının PPO' ı için optimum pH 7.0 olarak bulundu ve enzim aktivitesi 30 °C de 60 dakika süreyle pH 7.0-7.5 arasında stabil kaldı. Kereviz kökü ve yaprağı için optimum sıcaklık 30 °C dir. Enzim 60 dakika süreyle 20 ile 30 °C arasında stabil kaldı ve 70 °C de 2 dakika içinde tamamen inaktif hale geldi. Sukroz, (NH4)2S04, NaCI ve KCI kereviz PPO' in da koruma etkisi gösterdi. Substrat olarak katekol kullanıldığında pH 7.0 de kereviz kökü için aktivasyon enerjisi 17.9 kj/mol ve kereviz yaprağı 15.6 kj/mol' dür. PPO katekol, pirogallol, gallik asit ve kuinik asit için aktivite gösterdi. Substrat olarak katekol kullanıldığında kereviz kökü için Km 30 mM ve kereviz yaprağı için 17.5 mM' dır. L-tirozin de denendi, fakat kereviz PPO' su tarafından okside edilmedi. PPO aktivitesi üzerine çalışılan inhibitörlerin l50 yüzde aktivite grafikleri ile tayin edildi. Kereviz kökü için değerler sitrik asit, sodyum metabisülfit, potasyum siyanür, glutatyon, ditiyotreitol, sodyum azid, tiyoüre, okzalik asit, sodyum tiyosülfat, tartarik asit, IJ-merkaptoetanol, askorbik asid ve EDTA için sırasıyla, 2.63x1 0`2 M, 5.26x1 0'5 M, 2.80x1ü`5 M, 5.26x1 0`1 M, 2.10x1ü`5 M 5.33x10`5 M, 5.71x10`5 M, 1.16x10^ M, 2.80X10`5 M, 9.10x1ü`3 M, 5.30x10`6 M 5.20x10`5 M ve 4.17x1ü`4 M'd ir. Kereviz yaprağı için ise değerler, sırasıyla 2,94x1 0`2 M, 1.1 0x1 0`3 M, 5.70x1ü`5 M, 1.54x10`^M, 1.25x1ü`4 M, 1.90x10^ M 3.57x1 0-4 M, 4.76x10^ M, 5.30x1ü`5 M, 9.90x1ü`3 M, 1.43x1 0`5 M, 6.25x1 0`5 M ve 1.60x1ü`3 M olarak bulundu. 10 mM konsantrasyondaki metal iyonları (Zn++, Cu++, Mn++) kereviz kökünden ve yaprağından izole edilen enzim aktivitesi üzerine zayıf inhibitor etkisi gösterdi.

vıı ABSTRACT Polyphenol oxidase (PPO; monophenol dihydroxy-L-phenyalanine oxygen oxidoreductase, EC 1.14.18.1) is a copper enzyme widely distrubed on the phylogenic scale. Polyphenol oxidase (PPO) of celery (Apium graveoens L) was isolated by (NH4)2S04 precipitation and dialysis. The optimum pH for celery roots and leaves PPO were found as pH 7.0 and the enzyme activity were stable in the range of pH 7.0-7.5 at 30 °C for 60 min. The optimum temperature for celery roots and leaves were 30°C. The enzyme was stable between 20-30 °C for 60 min and completely inactivated at 70°C in 2 min. Sucrose, (NH4)2S04, NaCI and KCI appeared to be protective agent of celery PPO. The activation energy for celery roots when catechol used as a substrate was 17.9 kj/mol and for celery leaves was 15.6 kj/mol at pH 7.0. PPO showed activity for catechol, pyrogallol, gallic acid and quinic acid. Km for celery roors when catechol used as a substrate was 30 mM and for celery leaves was 17.5 mM. L-tyrosine was also tested but it did not oxidized celery PPO. The l50 values of inhibitors studied on PPO activity were determined by means of activity percentage (I50) diagrams. The values for celery roots were 2.63x1 0`2 M, 5.26x1ü`5 M, 2.80x1 0`5 M. 5.26x10-^ 2.10x1 0-5 M, 5.33x1 0`5 M, 5.71x10`S M, 1.16x1ü`4 M, 2.80x10`5 M, 9.10x10`3 M, 5.30x10`6 M, 5.20x10 M and 4.17x1ü`4 M for cidric acid, sodium metebisulfite, potassium ciyanide, glutathione, dithioteriotol, sodium azide, thiourea, okzalic acid, sodium tiosulfite, tartaric acid, p-mercaptoethanol, ascorbic acid and EDTA respectively. The values for celery leaves were 2,94x1 0`2 M, 1.10x10`3 M, 5.70x1 0`5 M, 1.54x10`* M, 1.25X10`4 M, 1.90X10`4 M, 3.57x1 0`4 M, 4.76x1 0`4 M, 5.30x1 0`5 M, 9.90x1 0`3 M, 1.43X10`5 M, 6.25x1 0`5 M and 1.60x10`3 M. Metal ions (Zn++, Cu++, Mn++) at 10 mM concentration showed poor inhibitor effects on enzyme activity isolated from celery roots and leaves.