Cloning of bile salt hydrolase gene (BSH) ) from human originated Lactobacillus plantarum and characterization of BSH enzyme by site directed mutagenesis

Abstract

Gastrointestinal mikrobiyota insan fizyolojisinde önemli bir rol oynar ve konağın beslenme, fizyolojik ve immünolojik fonksiyonlarından sorumludur. Gastrointestinal sistemin mikrobiyal kolonizasyonu, kolorektal kanser etiyolojisinin genetik faktörlerini önemli ölçüde etkiler. Litokolik asit ve deoksikolik asit gibi toksik sekonder safra asitleri, inflamasyon, DNA hasarı ve apoptoz indüksiyonunu etkileyerek kolon kanserine neden olmaktadır. Glisin ya da taurin ile konjuge safra asitlerinin hidrolizi, sekonder safra asitlerinin ortaya çıkması için bir geçiş reaksiyonudur. Çeşitli kaynaklardan elde edilen STH enzimlerinin (EC 3.5.1.24) karakterizasyonu, substrat tercihi ve spesifisiteleri farklılık göstermektedir. STH enzimi ve toksik sekonder metabolitler arasındaki ilişkiyi anlamak için, STH'nin yapısı daha iyi anlaşılmalıdır. Ancak STH enziminin yapısı ve çalışma mekanizması çok iyi bilinmemektedir. Enzimin yapısını ve işlevini anlamak için substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu düşünülen amino asitleri kodlayan bölgeye yönelik yönlendirilmiş mutagenez kullanılır. Bu çalışmada, 324-amino asitten oluşan Lactobacillus plantarum B14 STH geni klonlanmış ve kısmen korunmuş ve substrat özgüllüğünden sorumlu olduğu düşünülen Phe-18, Tyr-24, Asn-79, Leu-138 ve Asn-180 amino asitleri, yönlendirilmiş mutagenez ile değiştirilerek, enzim aktivitelerine bakılmıştır. Tüm STH 'ler E. coli BLDRE3-pET22b ekspresyon sistemi kullanılarak saflaştırılmıştır. Mutant enzimlerin ve her biri aynı molekül ağırlığı (37 kDa) ve stabilitesi SDS-PAGE ile doğrulanmıştır. Lb. plantarum B14'ün, STH aktivitesi, nicel olarak Direkt Plate Testi ve nitel olarak Ninhidrin Testi ile belirlenmiştir. Mutasyonların substrat özgüllüğü üzerindeki etkileri, altı farklı safra tuzları ile mutant STH enzimlerinin kısmen saflaştırılmasıyla araştırılmıştır. Araştırmada, Lb. plantarum B14 STH'ın tauro-konjuge safra tuzlarına kıyasla glisin ile konjuge safra tuzlarına daha fazla hidroliz sergilediği ve mutant enzimlerin STH aktivitelerinin, farklı safra tuzlarına farklı ölçüde azalan değişimler gösterdiği tespit edilmiştir.

The gastrointestinal microbiota plays an important role in human physiology and is liable for nutritional, physiological and immunological functions of the host. Microbial colonization of gastrointestinal system significiantly affect the genetic factors of colorectal cancer etiology. The microbial products of the toxic secondary bile acids such as lithocholic acid and deoxycholic acid caused colon cancer by influencing inflammation, DNA damage and apoptosis induction. The hydrolysis of glycine or taurine-conjugated bile acids is the gateway reaction for the occurrence of secondary bile acids. BSH enzymes (EC 3.5.1.24) from various sources rather differ in characteristics, substrate preference and specificity. To show relationship between BSH enzymes and toxic secondary metabolites, structure of the BSH must be better understood, but the structure and reaction mechanism of such an important BSH enzyme are not known very well. Site-directed mutagenesis is used to understand the structure and function of the enzyme due to the importance of the substitution of the codons coding amino acids supposed to be responsible for substrate specificity. In this study, Lactobacillus plantarum B14 BSH gene encoding 324-amino acids was cloned and the codons of the partially conserved amino acids, Phe-18, Tyr-24, Asn-79, Leu-138 and Asn-180 supposed to be responsible for substrate specificity, substituted by site directed mutagenesis. All mutant BSHs were purified using an E. coli BLDRE3-pET22b expression system. The stability of the mutant enzymes and molecular weight 37 kDa were confirmed by SDS–PAGE. The high BSH activity of Lb. plantarum B14 was determined qualitatively by Direct Plate Assay and quantitatively by Ninhydrin assay. The effects of the mutations on substrate specificity and catalytic activities of BSH were investigated by partially purified of mutant BSH enzymes with six different bile salts. The study showed that Lb. plantarum B14-BSH exhibited greater hydrolysis toward glyco-conjugated bile salts compared to tauro-conjugated bile salts and the BSH activities of mutant enzymes showed signifciantly decreasing alternations towards different bile salts.