Mutations of THR169 and PRO172 amino acids of BSH enzyme from lactobacillus plantarum and structural and functional analysis of the mutants

Abstract

Safra tuzu hidrolaz (STH) (EC 3.5.1.24) enzimi konakçının metabolizması üzerinde çok önemli bir role sahiptir. STH tarafından safra tuzlarında bulunan taurine ve glisin serbest bırakılabilir ki bu durum dekonjugasyon olarak adlandırılır. STH'ın bu özelliğinin sağlığa faydaları vardır örneğin kandaki kolestrolün düşmesini sağlar. Bu yüzden aktif STH içeren probiyotik türler hiperkolestrolemi kaynaklı hastalıkların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır. Buna ek olarak STH aktif türlerin antibiyotik büyüme promotor'e (AGP) alternatif olarak kullanılması araştırılmaktadır. Fakat safra tuzu dekonjugasyonu konakçı üzerinde yan etkileri de görülebilir. Yapılan çalışmalar STH ile kolorektal kanser, safra taşı ve bazı bağırsak hastalıkları arasında ilişki olduğunu göstermektedir. Bu nedenle STH enziminin çalışma mekanizmasını anlamak hayati önem taşımaktadır. BSH'ın insan üzerindeki etkileri iyi çalışılmış olsa da, onun katalitik aktivitesi, substart tercihleri ve katlanması hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu çalışmada Lactobacillus plantarum B14 türünden korunmuş iki amino asit, Thr-169 ve Pro-172, yönlendirilmiş mutagenez kullanılarak pCON1 konstraktı içinde sırasıyla Valin ve Histidin amino asitlerine dönüştürülüp, pET22b ekspresyon vektörüne aktarılmıştır ve Escherichia coli BRL(DE3) türünde ifade edilmiştir. Elde edilen mutant BSH enzimlerinin aktiviteleri altı farklı safra tuzu olan glikokolik asit, glikodioksikolik asit, glikokenodioksikolik, taurokolik asit, taurodeoksikolik asit ve taurokenodeoksikolik kullanılarak ninhydrin yöntemi ile belirlenmiştir. Sonuçlar T169V mutasyonunun BSH aktivitesini azalttığını göstermiştir. Bundan farklı olarak P172H mutantından inaktif enzim elde edilmiştir. Bu sırada, BSH proteinin bütünlüğü ve katlanması bu mutasyonlardan etkilenmediği görülmüştür. Bulgularımız bu iki aminoasit BSH enziminin katalitik aktivitesinden sorumlu olabileceğini fakat stabilitesinden sorumlu olamayacağını göstermektedir.

Bile salt hydrolase (BSH) (EC 3.5.1.24) has a very important role in host metabolism. Glycine and taurine in bile salts can be liberated by BSH which is called deconjugation. This property of BSH exert health benefits to the host such as reduction of blood cholesterol. Therefore BSH active probiotic strains are used in the treatment of hypercholesterolemia related diseases. Moreover, using BSH active strains as an alternative to antibiotic growth promoter (AGP) is under research. However, deconjugation of bile salts may have side effects to the host. Studies showed the relationship between BSH and a couple of diseases; colorectal cancer, cholesterol gallstone and bowel diseases. For this reason, understanding the mechanism of BSH enzyme is crucial. Even though BSH effects on human are well studied, there are not enough information about its mechanism of catalytic activity, substrate preferences and folding. In this study, two conserved amino acids, Thr-169 and Pro-172 from Lactobacillus plantarum B14 strain were substituted for valine and histidine respectively in pCON1 construct by site-directed mutagenesis then mutant bsh genes were inserted into the pET22b expression vector, and expressed in Escherichia coli BRL(DE3) strain. Mutant BSH enzyme activities were determined by ninhydrin assay with six different human bile salts, glycocholic acid, glycodeoxycholic acid, glycochenodeoxycholic acid, taurocholic acid, taurodeoxycholic acid, taurochenodeoxycholic acid. The results showed that T169V mutation decreased the activity of BSH. Distinctly; inactive enzyme was obtained from P172H mutant. Meanwhile, stability and folding of the BSH proteins were not affected by these mutations. Our finding demonstrated that these two amino acids might be responsible for catalytic activity of BSH enzyme but not for stability of it.