Investigation of physiological roles of strigolactones in sugar beet (Beta vulgaris L.) under in vitro tissue culture and ex vitro abiotic stress conditions

Abstract

Karotenoidlerden kökenlenen ve yeni nesil hormonlar olarak bilinen strigolaktonlar (SL), kök ve gövde oluşumunu düzenleyici, Striga, Orobanche ve Phelipanche gibi kök paraziti bitkilerin çimlenmesini uyarıcı, besin stresine karşı kök ve gövde oluşumunu düzenleyici, metabolik ve çevresel uyarıcılara tepki ve savunma mekanizmalarında etkili, ve sekonder büyümeyi teşvik eden bitki büyüme düzenleyicileridir. Bu bitki hormonları sınıfının, büyüme ve gelişmede çeşitli biyolojik rolleri olduğu için, şeker pancarında (Beta vulgaris) henüz tanımlanmamış sorumlu genlerin belirlenmesi, daha iyi ve üretken genotiplerin seçilmesi, veya in vitro olarak manipüle edildikten sonra, bu son derece önemli ve endüstriyel bitkinin üretimi için değerli bir bilgi sağlayacaktır. Öte yandan, tuzluluk ve kuraklık gibi çevresel stresler, bitki büyümesi üzerindeki olumsuz etkilerinden dolayı bitki verimliliğinde düşüşe yol açmaktadır. Farklı fitohormonlar stres tepkilerine katılır; ancak, bu önemli açıdan strigolaktonların (SL) rolü henüz açıklanamamıştır. Yukarıda belirtilen öneme ek olarak, SL'lerin in vitro şeker pancarı kültüründeki rollerinin açıklanması, doku kültürü yöntemlerinde ve belirli aşamaların optimizasyonunda daha büyük bir başarıya katkıda bulunabilir. Daha fazla bilgi için, tezin Giriş bölümünün okunması önerilir (Bölüm I). Bu nedenle, bu tez, MAX1 geninin SL'lerin biyosentezindeki veya sinyallemesindeki rollerini değerlendirmek ve şeker pancarında ilk kez sorumlu geni önermek/tanımlamak için hazırlanmıştır (Bölüm II). Bu, SL'lerin, dünyadaki bitki üretimi için inkar edilemez sorunlardan biri olan abiyotik stresler altında olumsuz etkilenen bitki koşullarının hafifletilmesine nasıl katkıda bulunabileceğini tahmin etmeyi içerecektir (Bölüm III). Ek olarak, tez çalışmasının bir bölümü, şeker pancarının doku kültürü üzerindeki çimlenmeden kök büyümesine kadar SL'lerin etkilerini araştırmaktır (Bölüm IV ve V). Bir sonraki amaç, SL'ler ile oksin arasındaki ilişkiyi hormonal bir etkileşim olarak incelemektir (Bölüm VI). Ek olarak, bu bulguların abiyotik stres toleransı yüksek bitki çeşitlerinin geliştirilmesine yönelik tarımsal araştırma faaliyetlerine katkıda bulunacağı da ümit edilmektedir.II. Bölümde, şeker pancarındaki MAX1 geninin olası ortolojisinin değerlendirilmesi için bir deney tanımlamıştır. Strigolakton hormonlarının (rac-GR24, (±) -strigol ve (±) -5-deoksistrigol) ve bir SL inhibitörünün (TIS108), Beta vulgaris subsp. vulgaris sitokrom P450 711A1 ekspresyon düzeyi üzerine etkisi çalışılmıştır. Bu gen ve referans gen (β-aktin) için birkaç farklı primer çifti kümesi, ilgilenilen genin ekspresyon seviyesini kantitatif olarak tahmin etmek için tasarlanmıştır. Ana deneylere başlamadan önce, ana deneyin fizibilitesini ve güvenilirliğini kontrol etmek için bir takım ön deneyler yapıldı. Püskürtme koşullarını kontrol etmek ve moleküler sonuçların kalitesini ve miktarını incelemek için ön deneyler yapıldı. Ön deneylerin sonuçları oldukça ümit verici olmuş, sonrasında ana deneyler yapılmıştır. Eksojen olarak uygulanan SL'lerin ilgilenilen genin ekspresyonu üzerindeki etkilerini değerlendirmek için, şeker pancarı cv. Serenada tohumları saksılara ekildi. Dört seviye (0, 2.5, 5 ve 7.5 M) kimyasal (rac-GR24, strigol, 5-deoksistrigol ve TIS108), her iki günde bir kez yedi kez, her seferinde 5 veya 10 ml ile püskürtülmüş, işlemler uyguladıktan sonra, bitkilerin yaprak örnekleri toplanmış, toplam RNA'ları çıkarılmış, cDNA'lar sentezlenmiş ve genin ekspresyon seviyelerindeki değişiklikler BioRad CFX connect Real-Time PCR cihazı kullanılarak kantitatif bir PCR (qPCR) yöntemine göre araştırılmıştır. qPCR analizinden elde edilen sonuçlar SL hormonlarının eksojen uygulamasının gen ekspresyonunu azalttığını göstermiştir. Öte yandan, SL inhibitörünün uygulanması ilgilenilen genin ifadesini arttırmıştır. Genel olarak, genin ekspresyonundaki azalma ve artış, uygulanan kimyasalların konsantrasyonları ile sırasıyla ters ve doğrudan orantılı olmuştur.Bölüm III, SL'lerin eksojen uygulamasının, saksıda yetişen tuzluluk ve kuraklığa strese maruz kalan şeker pancarı bitkileri üzerindeki etkilerini değerlendirmek için tasarlanmış bir deneyi anlatmaktadır. Toprağın özelliklerini analiz ettikten sonra, şeker pancarı bitkilerinin farklı tuzluluk seviyelerine ve kuraklık streslerine karşı tepkilerini değerlendirmek için bir ön deney yapılmıştır. Tuzluluk öncesi deneyi, saksı bitkilerinin, 50 gün boyunca 150 ml, 200 mM veya 250 mM içeren sulu bir NaCl çözeltisi ile sulanmasıyla gerçekleştirildi. Kuraklık öncesi deney, dört, altı veya sekiz gün boyunca sulamayı keserek gerçekleştirildi. Ön deneylerden gözlemlenen sonuçlar, 250 mM NaCl'nin ve altı gün boyunca sulamanın durdurulduğu koşulların asıl deneylerin yapılması için uygun olduğunu göstermiştir. Asıl deneyler için, on günlük fidelere iki hafta boyunca günde bir veya iki kez 10 M hormon (rac-GR24, St ve dSt) püskürtülmüştür. Sürgün numunelerinin toplanmasından sonra, morfoloji, katalaz (CAT) enzim aktivitesi, klorofil (Chl) içeriği ve malondialdehit (MDA) içeriği üzerindeki etkileri su püskürtülmüş kontrol bitkileriyle karşılaştırılmıştır. Asıl deneyler yapıldıktan sonra bitkilerin gözlemlenmesi, tüm hormonal işlemlerin bitkilerin tuzluluk ve kuraklık streslerine karşı toleransını arttırdığını göstermiştir. Genel bir bakış açısına göre, Chl a ve toplam Chl (Chl T) miktarının arttırılması üzerindeki hormonal uygulma etkileri önemliyken, Chl b üzerindeki etkileri anlamlı değildi. Bununla birlikte, strese maruz kalan bitkilerde CAT enzim aktivitesi üzerindeki hormonal uygulama etkileri istatistiksel olarak anlamlı değildi. Öte yandan, hormonal uygulamalar genellikle bitkilerde MDA miktarını azaltı.Bölüm IV, SL hormonlarının şeker pancarı tohumlarının çimlenmesi üzerindeki etkilerini incelemek için önerilen bir yöntemi açıklamaktadır. Uygulanan hormonal uygulamalar, yarı kuvvetli bir MS ortamına eklenmiş ve 10 g L-1 sukroz ile takviye edilmiş, rac-GR24, St, dSt ve TIS108 olmuştur. Hormonal uygulamaların konsantrasyonları 0 (kontrol), 2.5, 5 ve 7.5 M idi. Deney, in vitro koşullarda yapıldı. Hormon içeren ortamda tohumların ekiminden on dört gün sonra, çimlenmiş tohumların yüzdesi hesaplandı. Sonuçlar, hormonal uygulamaların şeker pancarı tohumunun çimlenmesi üzerindeki etkilerinin istatistiksel olarak anlamlı olmadığını göstermiştir.Bölüm V, SL'lerin şeker pancarının in vitro doku kültürü üzerindeki etkilerini inceleyen bir yöntemi tanımlamaktadır. Bu deneyde, tohumları çimlendirmek için, hazır ortam olarak yarı-kuvvetli bir MS kullanılmıştır. Tohumların in vitro ortamda çimlenmesinden sonra, eksplantlar, 30 g L-1 sukroz, ve 0 (kontrol), 2.5, 5 ve 7.5 M rac-GR24 içeren tam güçte MS ortamı içeren bir ortam üzerinde alt kültüre alındılar. Kültür başlangıcından bir ay sonra, sürgün oluşumu ve kök büyümesi gözlendi. Şeker pancarı eksplantlarına rac-GR24 uygulanması, yaprak sayısını, toplam yaprak uzunluğunu ve toplam yaprak alanını önemli ölçüde azalttı. Benzer şekilde, in vitro ortama rac-GR24 ilavesi, şeker pancarı eksplantlarındaki kök uzunluğunu azaltmıştır. Ölçülen parametrelerdeki düşüş istatistiksel olarak anlamlıydı ve ortamdaki rac-GR24 konsantrasyonu ile ters orantılıydı. Bölüm VI, SL'nin oksin ile etkileşimlerini in vitro koşullarda incelemek için bir protokol tanımlamaktadır. Ortamdaki tohumların çimlenmesinden sonra, eksplantlar, 30 g L-1 sukroz ile takviye edilmiş, ancak çeşitli miktarlarda SL ve oksin hormonları (rac-GR24 ve IAA) ve SL ve oksin inhibitörleri (TIS108 ve TIBA) içeren tam kuvvetli bir MS ortamı içeren bir ortamda alt kültüre alındılar. Kimyasalların toplam yedi farklı kombinasyonu hazırlandı. Kültürün başlamasından dört hafta sonra, farklı bitki büyüme düzenleyicilerinin etkileşiminin yaprak sayısı, yaprakların uzunluğu, yaprakların alanı, şeker pancarı eksplantlarındaki köklerin uzunluğu üzerindeki etkileri gözlenmiştir. Uygulamaların etkileri istatistiksel olarak anlamlıydı. En yüksek yaprak sayısı ve en uzun yaprak, kontrol, TIS108 ve TIS108 + IAA uygulamalarında gözlenirken, en düşük veriler TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 içeren uygulamalarda kaydedilmiştir. . En büyük yaprak alanı kontrol ve TIS108 uygulamaları için kaydedildi. En küçük alanlar TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 içeren ortamlarda elde edildi. Kontrol koşullarında yetişen şeker pancarı eksplantları en uzun kökleri oluştururken, en kısa olanları TIBA + GR24, TIBA + GR24 + IAA ve TIBA + GR24 + IAA + TIS108 ile desteklenmiş ortamlarda kültüre alınan eksplantlar için kaydedilmiştir. Kontrol, TIS108 ve TIS108 + IAA uygulamaları en fazla kök üretti, ancak diğer uygulamalar en az kök sayısına neden oldu.Bölüm VII, bu araştırma tezinde açıklanan deneylerden elde edilen sonuçları içermektedir. Şeker pancarındaki (B. vulgaris) incelenen genin (cytochrome P450 711A1) Arabidopsis'te MAX1 geninin bir ortologu olduğu görülüyor. Gen, muhtemelen şeker pancarı içindeki SL'lerin biyosentez yolunda rol oynamaktadır. Ek olarak, SL'ler, şeker pancarı sürgün ve köklerinin mimarilerinin in vitro koşullarda değiştirilmesinde etkilidir. SL'lerin, in vitro şeker pancarı eksplantlarının büyümesi üzerinde inhibe edici bir etkisi olduğu görülmektedir. SL'ler şeker pancarı bitkileri için tuzluluk ve kuraklık koşullarının zararlı etkilerini hafifletebilir gibi görünüyor. Ayrıca, SL'lerin doğrudan ve oksinden bağımsız olarak hareket edebildiğini göstermektedir.

Strigolactones (SLs), as carotenoid-derived compounds and recently introduced plant hormones, have wide-ranging biological roles ranged from both shoot and root architecture, plant communication in the rhizosphere, stimulation of germination in root parasitic plants, such as Striga, Orobanche and Phelipanche species, seed germination, responses to environmental stresses, modulators of root and shoot development in response to nutrient-deficient conditions, regulation of plant defense, and stimulation of secondary growth. Since this class of plant hormones has various biological roles in the growth and development, the recognition of responsible genes, which have not been recognized yet in sugar beet (Beta vulgaris), will provide a valuable knowledge in order to select better and productive genotypes, or to be manipulated in vitro, then to breed this highly important and industrial crop species. On the other hand, environmental stresses like salinity and drought lead to a reduction in the productivity of plants due to their adverse effects on plant growth. Different phytohormones are involved in stress responses; however, the role of strigolactones (SL) in this important respect has not been elucidated yet. In addition to the above-mentioned importance, deciphering SLs roles in in vitro culture of sugar beet may contribute to a greater success in its tissue culture methods and optimization of the certain stages. To know more, it is encouraged to read the Introduction section of the thesis (Chapter I). Therefore, this thesis has been defined to evaluate the roles of MAX1 gene in biosynthesis or signaling of SLs and hopefully to suggest/introduce the responsible gene for the first time in sugar beet (Chapter II). It will include estimates how SLs could contribute to alleviating the adversely affected plant conditions under abiotic stresses, which are one of the undeniable problems for plant production throughout the world (Chapter III). In addition, one part of the thesis research is to understand the SLs effects on tissue culture of sugar beet from germination to root growth (Chapter IV and V). The next purpose is investigating the relationship between SLs and auxin as a hormonal interaction (Chapter VI). In addition, it is hoped that such findings will contribute to agricultural research activities aiming at the development of plant varieties with high abiotic stress tolerance.Chapter II describes an experiment for the evaluation of a putative ortholog of MAX1 gene in sugar beet. The effects of strigolactone hormones (rac-GR24, (±)-strigol and (±)-5-deoxystrigol) and one SL inhibitor (TIS108) on the expression level of Beta vulgaris subsp. vulgaris the gene encoding Cytochrome P450 711A1 were studied. A few sets of different primer pairs for this gene and a reference gene (β-actin) were designed to estimate the expression level of the gene of interest quantitatively. Before starting the main experiments, a few sets of pre-experiments were devised to check the feasibility and reliability of the main experiment. The pre-experiments were done for checking the spraying conditions, and examining the quality and quantity of the molecular results. Since the results of the pre-experiments were highly promising, the main experiments were done. To evaluate the effects of exogenously applied SLs on the expression of the gene of interest, sugar beet cv. Serenada seeds were sown in pots. They were sprayed with four levels (0, 2.5, 5, and 7.5 µM) of the chemicals (rac-GR24, strigol, 5-deoxystrigol, and TIS108), once every two days for seven times, each time with 5 or 10 ml of an aqueous solution of the chemicals. After applying the treatments, leaf samples of the plants were collected, their whole RNA was extracted, cDNAs were synthesized, and the changes in the expression levels of the gene were investigated based on a quantitative PCR (qPCR) method using BioRad CFX connect Real-Time PCR instrument. The results obtained from the qPCR analysis indicated that exogenous application of the SL hormones decreased the expression of the gene. On the other hand, application of the SL inhibitor increased the expression of the gene of interest. Generally, the decrease and increase in the expression of the gene were respectively inversely and directly proportional to the concentrations of the applied chemicals.Chapter III describes an experiment designed to evaluate the effects of exogenous application of SLs on salinity- and drought-stress exposed sugar beet plants growing in pots. After analyzing the properties of soil, a pre-experiment was carried out to assess the response of the sugar beet plants to different levels of salinity and drought stresses. The salinity pre-experiment was performed by irrigating the potted plants with 50 ml of an aqueous solution of NaCl containing 150 mM, 200 mM, or 250 mM over ten days. The drought pre-experiment was performed by withholding irrigation for four, six, or eight days. The observed results from the pre-experiments suggested that 250 mM NaCl and withholding irrigation for six days were the proper conditions for conducting the main experiments. For the main experiments, ten-day-old seedlings were sprayed with 10 µM of the hormones (rac-GR24, St, and dSt) once or twice per day over two weeks. After collecting shoot samples, the treatment effects on morphology, catalase (CAT) enzyme activity, chlorophyll (Chl) content, and malondialdehyde (MDA) content were compared with water-sprayed control plants. Observation of the plants after running the main experiments indicated that all the hormonal treatments increased the plants' tolerance to salinity and drought stresses. In a general point of view, the hormonal treatment effects on increasing the amounts of Chl a and the Chl total (Chl T) were significant, whereas their effects on Chl b were not significant. However, the hormonal treatment effects on CAT enzyme activity in the stress-subjected plants were not statistically significant. On the other hand, the hormonal treatments generally decreased the amount of MDA in the plants.Chapter IV describes a method proposed to examine the effects of the SL hormones on the germination of sugar beet seeds. The applied hormonal treatments were rac-GR24, St, dSt, and TIS108, mixed in a half-strength MS medium, and supplemented with 10 g L−1 sucrose. The concentrations of the hormonal treatments were 0 as control, 2.5, 5 and 7.5 µM. The experiment was done in in vitro conditions. Fourteen days after sowing the seeds in the hormone-containing media, the percentage of the germinated seeds were calculated. The results indicated that the effects of the hormonal treatments on seed germination of sugar beet were not statistically significant.Chapter V describes a method to study SLs effects on in vitro tissue culture of sugar beet. In this experiment, to germinate the seeds, a half-strength MS was used for the common medium preparation. After germinating seeds in in vitro medium, the explants were subcultured on a common medium containing full-strength MS medium supplemented with 30 g L−1 sucrose, plus 0 as control, 2.5, 5 and 7.5 µM rac-GR24. One month after culture initiation, shooting pattern and root growth were observed. Treating sugar beet explants with rac-GR24 significantly decreased the number of leaves, the total length of leaves, and the total area of leaves. Similarly, rac-GR24 addition to the in vitro medium decreased the length of root in sugar beet explants. The decrease in the measured parameters was statistically significant, and it was inversely proportional to the concentration of rac-GR24 in the medium.Chapter VI describes a protocol to study the interactions of SL with auxin in in vitro conditions. After germinating seeds in the medium, the explants were subcultured on a common medium containing a full-strength MS medium supplemented with 30 g L−1 sucrose, but with varied amounts of SL and auxin hormones (rac-GR24 and IAA), and SL and auxin inhibitors (TIS108 and TIBA). Totally seven different combinations of the chemicals were prepared. Four weeks after culture initiation, the effects of the interaction of different plant growth regulators on the number of leaves, the length of leaves, the area of leaves, the length and the number of roots in sugar beet explants were observed. The effects of the applied treatments were statistically significant. The highest number of leaves and the longest leaves were observed for control, TIS108, and TIS108+IAA treatments, whereas the lowest numbers were recorded for the treatments containing TIBA+GR24, TIBA+GR24+IAA, and TIBA+GR24+IAA+TIS108. The largest leaf area was recorded for control and TIS108 treatments, while the smallest areas were produced in the media containing TIBA+GR24, TIBA+GR24+IAA, and TIBA+GR24+IAA+TIS108. The sugar beet explants growing in control conditions produced the longest roots, whereas the shortest ones were recorded for the explants treated in TIBA+GR24, TIBA+GR24+IAA, and TIBA+GR24+IAA+TIS108 supplemented media. Control, TIS108, and TIS108+IAA treatments produced the highest number of roots, but the other treatments resulted in the lowest number of roots.Chapter VII includes the conclusions driven from the experiments described in this research thesis. It seems that the studied gene (encoding Cytochrome P450 711A1) in sugar beet (B. vulgaris) is most likely an ortholog of MAX1 gene in Arabidopsis. The gene is likely involved in the biosynthesis pathway of SLs in sugar beet. In addition, SLs are effective in modifying sugar beet shoot and root architectures in in vitro conditions. SLs seem to have an inhibitory effect on the growth of the in vitro sugar beet explants. It seems that SLs can alleviate the deleterious effects of salinity and drought conditions for sugar beet plants. Moreover, it suggests that SLs can act directly and independent of auxin.