Sperm hazırlama yöntemlerinin sperm kromatin kondensasyonu ve DNA hasarı üzerine etkisi

Abstract

İnfertilite günümüzde giderek artan bir sorun haline gelmekte olup infertil çiftlerin yaklaşık %20'si yalnızca erkek faktörden kaynaklanmaktadır. Erkek faktör değerlendirilmesinde sıklıkla DSÖ (WHO) kriterlerine uygun standart semen analizi yapılmaktadır. Fakat semen analizi sperm DNA hasarları hakkında bilgi vermemektedir. Sperm DNA hasar mekanizmalarından en önemlilerinden biri anormal ya da düzensiz kromatin paketlenmesidir. Spermatogenez sürecinde spermatid kromatini kompaksiyon süreci geçirir ve histon proteinleri sperme özgü protamin proteinleri ile yer değiştirerek sperm kromatin kondensasyonunu gerçekleştirir. Kromatin kondensasyon sürecinin normal olmaması spermlerde gelişimsel anomalilere neden olur. Sperm DNA fragmantasyon indeksi ve maturasyon defekti oranlarına bakılarak fertilizasyonda kullanılacak spermler hakkında bir öngörü sağlanabilir. Gradient ve swim-up yöntemleri günümüzde IVF laboratuvarlarında rutin olarak uygulanan IVFICSI öncesi sperm hazırlama teknikleridir. Gradient yöntemi anormal ve normal spermlerin yoğunluk farklılıklarından faydalanarak ayırma işlemi sağlarken, swimup yöntemi spermlerin hızlı olanlarının üst faza yüzmesi ile ayrışmayı sağlar. Her iki yöntem de en kaliteli, yüksek motilite ve normal morfolojiye sahip spermleri elde etmeyi amaçlarken semenden sperm dışı hücrelerle birlikte ölü, hareketsiz spermleri ayırmayı sağlar. Çoğunlukla IVF laboratuvarlarında spermle ilgili yapılan tüm işlemler 37° C gerçekleştirilir. Bu çalışmada normospermi ve oligoastenoteratospermi olgularında farklı semen hazırlama yöntemleri kullanarak, hazırlama işleminin maturasyon defekti olan spermleri ayrıştırması ve aynı zamanda oda sıcaklığı (22 °C) ve 37° C 'nin sperm DNA fragmantasyonuna etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Çalışma 'Biruni Üniversitesi Girişimsel Olmayan Etik Kurul'una sunuldu ve 2018-12-9 sayı ve 29.01.2018 tarihli etik kurul onayı alındı. Çalışma Ocak 2018Haziran 2018 tarihleri arasında Biruni Üniversite Hastanesi'ne spermiyogram analizi için başvuran hastalarda uygulandı. Bu çalışmada; Biruni Üniversite Hastanesi Üroloji polikliniğine başvuran hastalardan normospermi(n:20) ve oligoastenoteratospermi gruplarında (n:20) WHO kriterlerine uygun standart semen analizi uygulanarak ardından asidik anilin mavisi boyama yöntemi ile sperm maturasyon defekti ve acridin orange boyama yöntemi ile sperm DNA fragmantasyon hasarı değerlendirilmiştir. Gradient ve swim-up yöntemleri kullanılarak yapılan sperm ayrıştırma sonrası gruplar kendi içinden ayrılarak oda sıcaklığı (22 °C) ve 37° C 'de 1 saat inkübasyon yapılmış olup inkübasyon sonrası yeniden asidik anilin mavisi boyama ve acridin orange boyama yapılarak öncesindeki DNA fragmantasyon indeksi ve sperm maturasyon defekti ile uygulama sonrası elde edilen değerler karşılaştırılmıştır. Bu tez çalışmasına göre sperm hazırlama yöntemi olarak swim-up ve gradient yöntemlerinin arasında motil sperm, sperm sayısı ve morfolojisi açısından anlamlı farklılık bulunmamış olup motilite ve konsantrasyon parametreleri gözönüne alınarak iki yöntem de olgunun durumuna göre tercih edilebilir. Sperm immaturasyonu ve DNA fragmantasyonu açısından da gerek dansite gradient ve gerekse swim up yöntemi ile azaldığı gösterilmiştir. Özellikle oligoastenoteratospermi olgularında normospermiye kıyasla, 37°C de inkübasyonun özellikle DNA fragmantasyonu açısından kötü etkileri ortaya çıkmıştır. Sperm DNA hasarını en aza indirmek için inkübasyon 37°C ye göre oda sıcaklığında gerçekleştirilebilir. En fonksiyonel ve DNA hasarının en az olduğu ayrıştırma ve inkübasyon sıcaklıklığının swim-up ve oda sıcaklığı (22°) olduğu gösterilmiştir.Anahtar kelimeler: DNA hasarı, gradient, swim-up, DNA fragmantasyonu

Infertility problem is a increasing day by day, approximately 20% of infertile couples are caused only by male factor). In the evaluation of the male factor, standard semen analysis is performed according to WHO criteria. However, semen analysis does not provide information about sperm DNA damage. One of the most important mechanisms of sperm DNA damage is abnormal or irregular chromatin packaging. In the process of spermatogenesis, the spermatid chromatin undergoes a compaction process and the histone proteins carry out the condensation of sperm chromatin by replacing them with sperm specific protamine proteins. Abnormal chromatin condensation process causes developmental anomalies in sperm. Sperm DNA fragmentation index and maturation defect rates can be related with infertility. Gradient and swim-up methods are the pre-IVF-ICSI sperm preparation techniques that applied routinely in IVF laboratories. Swim-up method allows the separation of the spermatozoa from the fast ones to the upper phase while the gradient method provides separation by utilizing the density differences of abnormal and normal sperm. Both methods aimed to obtain the highest quality, high motility and normal morphology. Semen with non-sperm cell allows to eleminate dead immobilized sperm. Mostly, all procedures are performed at 37 ° C in IVF laboratories .The aim of study was to investigate the effect of different semen preparation in different temperatures on the separation of sperm, control in with maturation defect and DNA fragmentation. The study was submitted to the Biruni University Ethics Committee and was approved in 2018-12-9 and dated 29.01.2018. The study was applied to the Biruni University Hospital between January 2018 and June 2018 in patients who applied for spermiogram analysis. In study; Patients admitted to the Biruni University Hospital Urology outpatient clinic. Standard semen analysis was performed according to WHO criteria in normospermia (n: 20) and oligoastenoteratospermia (n: 20) groups, followed by sperm maturation defect with acidic aniline blue staining method and sperm DNA fragmentation damage by acridin orange staining method. After separation of the sperm by using gradient and swim-up methods, the groups were separated from them and incubated at room temperature (22 ° C) and 37 ° C for 1 hour, followed by incubation with acidic aniline blue staining and acridin orange 4 staining prior to DNA fragmentation index. Sperm maturation defect was compared with the values obtained after the application. According to this thesis, there is no significant difference between the swim-up and gradient methods in terms of motile sperm, sperm number and morphology as a sperm preparation method and it can be preferred according to the condition of motility and concentration parameters. In terms of sperm immaturation and DNA fragmentation, it has been shown to decrease with density gradient and swim up method. Especially in cases of oligoasthenoteratospermia, the incubation at 37 ° C had bad effects especially on DNA fragmentation compared to normospermia. Incubation can be carried out at room temperature to minimize sperm DNA damage.In this study it has been shown that the most functional incubation temperature at the swim-up or gradient technique are room temperature (22 °C ). Key words: DNA damage, gradient, swim-up, DNA fragmentation