Development of rapid and accurate IDH1 mutation detection system that is compatible for intraoperative diagnosis

Abstract

İsositrat I ve II (IDH1, IDH2) malformasyonları, hücresel enerji metabolizmasına etki eden mutasyonlardır. IDH1 ve IDH2 mutasyon varlığının uygulanan kanser tedavilerine verilen olumlu cevap ile yakından ilişkileri ve glioma hastalarındaki sıklıkları, bu mutasyonları önemli kılmaktadır. Bu çalışma, ameliyat sırasında IDH1 mutasyonlarını hızlı ve doğru şekilde analiz eden bir tespit sistemi geliştirip cerraha tümör habisliği ile ilgili bilgi vermeyi amaçlamaktadır. Çalışmanın basamakları, alkaline lysis ile DNA çıkarma ve yeni bir nokta mutasyonu tespit sistemi kullanılarak nokta mutasyonlarını analiz etmekten oluşmaktadır. Bu sayede retrospektif biçimde 226 ve prospektif biçimde 10 gliom örneği yüzde 100 doğruluk ile maksimum 67 dakikada analiz edilmiştir. Bu yolda başvurulan optimizasyon deneyleri de tartışılarak ortaya konmuştur. Ayrıca, bulunan tespit sisteminin öneminden ve IDH1/2 mutasyonlarının kanser tedavisini nasıl etkilediğinden de bahsedilmiştir. Gliom hastalarının yaklaşık yüzde 74'ünde görülmelerinin yanı sıra, IDH1 ve IDH2 nokta mutasyonlarını içeren gliomların kanser tedavisine olumlu cevap vermeleri, dolayısıyla iyi prognoz ile olan ilişkileri bilinmektedir. Buna ek olarak, IDH1 R132H nokta mutasyonu sıklığı diğer IDH1/2 mutasyonlarının yüzde 90'ından fazladır. Bu nedenden dolayı, IDH1 mutasyon durumunun ameliyat öncesi veya sırasında beyin cerrahı tarafından bilinmesi, uygulanacak rezeksiyon tipinin belirlenmesi açısından çok önemlidir. Çünkü, IDH1/2 mutasyonları tümör habisliği ile doğrudan ilişkilidir. Çalışmada 3-mismatch-ARMS (3m-ARMS) tekniği optimize edilerek amaçlanan seviyeye geirilmiştir. 3m-ARMS, amplifikasyon refrakter mutasyon sistemi (ARMS) bazlı bir nokta mutasonu tespit sistemidir. Çalışma prensibi, tasarlanan primerin 3' ucuna ardı ardına sıralanmış ve doğal suş alleli ile yapılan üç adet baz uyumsuzluğuna dayanır. Konvansiyonel ARMS tekniğinin farkı ise primer ve doğal suş arasında oluşan iki adet baz uyumsuzluğuna dayanıyor olmasıdır. 3m-ARMS, mutant allel söz konusu olduğunda ise aynı primer 3' ucunda uyumlu bir eşleşme ardından ise iki adet baz uyumsuzluğuna sebep verir. Bu sayede selektif bir PCR ortamı oluşarak mutant allel doğal suş arasından ayırt edilir. Bu çalışmada IDH1 geninde görülen en yaygın nokta mutasyonları ele alınmıştır. Bunlar; IDH1 G395A ve IDH1 C394G nokta mutasyonlarıdır. Bu nokta mutasyonları, toplamda 236 glial tümörde optimize edilmiş, 3m-ARMS yöntemi ile incelenmiştir. İncelemelerin doğruluğunu başka yöntemler ile kıyaslamak amaçlı örnekler Sanger sekanslama ve immunohistokimya ile analiz edilmiştir. Uygun baz uyumsuzluğunun konvansiyonel ARMS primer tasarımına eklenmesi ile, 236 glial tümör Sanger sekanslama yöntemi baz alınarak yüzde yüz doğrulukla analiz edilmiştir. İmmunohistokimya ile korelasyon sonrası, 3m-ARMS tekniğinin üstün olduğu görülmüştür. Konvansiyonel Sanger sekanslamasının aksine 3m-ARMS, 236 glial hastayı, mutant spesifik amplifikasyona gerek kalmadan başarıyla tespit etmiştir. Bu, 3m-ARMS tekniğinin Sanger sekanslamaya kıyasla daha hassas olduğunu göstermektedir. Hassaslık 3m-ARMS tespit sisteminin en önemli özelliklerden biridir çünkü tespit için kullanılan DNA kaynağı mutant ve doğal suş açısından heterojendir. Bu heterojenite genellikle mutant DNA'nın doğal suşa oranla çok daha az bulunmasıdır. Bundan dolayı, 3m-ARMS'ın sensitivitesini ve spesifitesini test etmek amaçlı klonlama ve mutajenez teknikleri kullanılarak istenilen nokta mutasyonlara ait plazmidler ve oranını kendimiz belirlediğimiz mutant DNA stokları elde edilmiştir. Bu testler sonrası primere spesifik mutasyon içeren reaksiyon, içermeyene oranla 14 döngü önceden başlamıştır. Ayrıca, femtogram seviyesinde DNA içeren reaksiyonlarda bile spesifik sonuçlar alınmıştır. Klonlama ve mutajenez metodları sayesinde IDH2 G515A mutasyonu da 3m-ARMS ile incelenmiştir ve spesifik sonuçlar vermiştir. 3m-ARMS sayesinde, IDH1 mutasyonları operasyon sırasında yüksek sensitivite ve spesifiteyle tespit edilebilir. Bu nedenle, 3m-ARMS, intraoperatif diagnostik analiz için kullanılabilecek yeni bir tespit sistemidir. Son olarak, gliomların saldığı ve kanda serbest dolaşan tümör DNA'ları da plazma örnekleri kullanılarak 3m-ARMS metodu ile incelenmiştr. Ancak, ameliyat öncesi kan örneklerinden genotipleme konusunda başarılı sonuçlara ulaşmak için daha fazla optimizasyon deneyi gereklidir. Gelecekte, IDH2 analizini de alkaline lysis metoduna adapte etmeyi ve TERT promotör mutasyonları gibi başka nokta mutasyonlarını da tekniğimize adapte etmeyi umuyorz. Buna paralel olarak, ctDNA araştırmaları devam edecektir.

Isocitrate dehydrogenase I and II (IDH1, IDH2) malformations are marked as cellular energy metabolism altering mutations related with good prognosis upon treatment and are highly frequent in glioma patients. In this study, rapid and accurate intraoperative diagnosis of the IDH1 mutational status was focused in order to inform the neurosurgeon intraoperatively. Steps of analysis were composed of alkaline lysis DNA extraction based novel modified point mutation detection system, which achieved 100 percent accuracy in retrospective analysis of 226 glioma samples, alongside with prospective analysis of 10 glioma samples in maximum 67 minutes. Working principle of utilized techniques were explained alongside with the optimization experiments and the importance of the IDH1/2 mutations on cancer treatment. Besides their approximately 74 percent frequency in gliomas, point mutations of IDH1 and IDH2 genes that reside in glioma patients is directly proportional with good prognosis due to better answer to anti-cancer treatments. Moreover, the frequency of IDH1 R132H mutation is more than 90 percent. As a novel detection tool, 3-mismatch-ARMS technique (3m-ARMS) was optimized in order to achieve our aim. 3m-ARMS is amplification refractory mutational system (ARMS) based point mutation detection system based on three consecutive mismatches at the 3'end between primer and the wild-type allele besides the conventional ARMS that have two consecutive mismatches at the 3'end. In the case of mutant allele, 3m-ARMS primer makes a match at the 3'end followed by two consecutive mismatches used for selective PCR amplification in order to achieve discrimination of mutant alleles. This study focuses the most widespread point mutations of IDH1 gene, which are IDH1 G395A and IDH1 C394G point mutations. These point mutations examined in 236 glial tumor samples via optimized 3m-ARMS technique followed by Sanger sequencing and immunohistochemistry analysis in order to correlate their accuracies. The addition of the appropriate mismatch to the conventional ARMS method, 236 glial tumor sample were analyzed with one hundred percent accuracy when compared with Sanger sequencing methodology. After correlation with immunohistochemistry, 3m-ARMS has been also shown better accuracy when compared to immunohistochemistry analysis. Contrary to conventional Sanger sequencing, 3m-ARMS had successfully analyzed 236 glioma sample without the requirement of mutant specific amplification. This shows the sensitivity of 3m-ARMS is superior compare to Sanger sequencing. Sensitivity is the most important trait of 3m-ARMS due to the deoxynucleic acid (DNA) source used for detection is heterogeneous in terms of mutant and wild-type allele numbers, as the mutant containing alleles present in the DNA mixture present at much lower frequency compared to wild-type allele. Additionally, we test our specificity and sensitivity by creating our own mutant to wild type ratios and point mutation involving plasmids via cloning and mutagenesis techniques. Quantitatively, up to 14 cycle superiority has been observed in constructs specific to 3m-ARMS primers alongside with all or none detection was achieved at femtogram level. By the help of cloning and mutagenesis methods, IDH2 G515A mutation was also analyzed with 3m-ARMS principle and gave all or none results. With 3m-ARMS, detection of IDH1 mutations can be held during an operation with robust sensitivity and specificity. Thus, it is a novel detection method, which can be used intraoperatively for diagnostic analysis. Lastly, circulatory DNA released by glioma cells also analyzed by using plasma samples with 3m-ARMS method. However, more experiments are required for the future of successful genotyping from blood samples prior to surgical operation. As future prospect, IDH2 will be adapted to alkaline lysis alongside with other point mutations such as TERT promoter mutations in parallel to ctDNA optimizations.