An in vitro culture protocol, analysis of saponin and bioassay of biological activity of Verbascum thapsus L. , a medicinal plant

Abstract

ÖZET TIBBİ BİR BİTKİ OLAN VERBASCUM THAPSUS L.'UN İN VİTRO KÜLTÜR PROTOKOLÜ, SAPONİN ANALİZİ VE BİYOLOJİK AKTİVİTESİNİN DEĞERLENDİRİLMESİ Türker Uçar, Arzu Ph.D., Biyoloji Bölümü Tez Danışmanı: Doç. Dr. Ekrem Gürel Haziran 2002, 127 Sayfa Verbascum thapsus L. (sığır kuyruğu) akciğer problemleri, iltihablı hastalıklar, astım, öksürük, ishal ve migren ağrılarında kullanılan tıbbi bir bitkidir. V. thapsus L. için güvenilir bir in vitro çoğaltım protokolü geliştirilmiştir. Eksplantlar (yaprak diskleri, petiyoller ve kökler) benziladenin (BA) veya kinetinin (KIN) bulunduğu Murashige ve Skoog minimal organik (MSMO) ortamı içerisinde kültüre alınmışlardır. Yaprak diskleri ve petiyollerden en iyi gövde oluşumu 3 mg/l BA içeren ortamlarda elde edilmiştir. Ayrıca yaprak diskleri 3 mg/l BA'nın naftelen asetik asit (NAA) veya 2,4-diklorofenoksi asetik asit (2,4-D) ile kombinasyonunu içeren ortamlarda kültüre alınmış ve en fazla gövde oluşumu 3 mg/l BA ve 1 mg/l NAA kombinasyonunda elde edilmiştir. Gövdeler vıfarklı düzeylerde NAA veya 2,4-D içeren köklendirme ortamlarına geçirilmiştir. En fazla kök oluşumu 1 mg/l NAA içeren ortamda gözlenmiştir. V. thapsus L. bitkisinde bulunan saponinler için bir ekstraksiyon ve analiz metodu geliştirilmiştir. Dört çeşit bitki örneği analiz edilmiştir. Şifalı bitki olarak satılan yapraklardan tespit edilen saponin miktarı (0.215 mg/g doku) in vitro kültürü yapılmış ve arazide yetişmiş bitkinin yapraklarından (0.081 ve 0.198 mg/g doku) veya kapsüllerde (0.016 mg/g doku) bulunan miktardan daha fazla olmuştur. Laboratuvarda elde edilen sığır kuyruğu ekstraktının ve ticari olarak satılan bu bitkinin ürünlerinin biyolojik aktiviteleri çeşitli biyolojik testler kullanılarak değerlendirilmiştir. Antibakteriyal, antitümor ve iki farklı toksisite testi (brine shrimp ve turp tohumu biyolojik testleri). Genel olarak su ile hazırlanmış ekstraklar daha etkili olmuş ve K. pneumoniae and S. aureus'a karşı antibakteriyal etki göstermişlerdir. Bitkinin ticari ürünleri ve diğer test edilen saponinler bu bakterilere karşı çok az antibakteriyal etki göstermişler veya hiç göstermemişlerdir. Bütün sığır kuyruğu ekstrakları, ticari ürünleri ve test edilen saponinler patates dokusunda Agrobacterium tumefaciens tarafından oluşturulan tümörleri inhibe etmiştir. In vitro yetiştirilmiş ve satın alınmış yaprakların metanol ile yapılan ekstraksiyonu tümör oluşumunu diğer metanolik, etanolik ve suyla yapılan ekstraklardan daha fazla inhibe etmiştir. Brine shrimp vııbiyolojik testinin sonuçları sığır kuyruğu ekstraklarının yüksek dozlarda (1,000 mg/l civarında) toksik olduğunu göstermiştir. Su ile yapılan ekstraklar arasında, kaynatılarak hazırlanan ekstrakın (LC50 < 1,000 mg/l) kaynamış suya batırıp demlenme ile hazırlanan ekstrakta oranla çok daha fazla toksik olduğu gözlenmiştir. Turp tohumu biyolojik testinde yüksek dozlarda (10,000 mg/l) bütün ekstraklar turp kök uzunluğunu azaltmasına rağmen, düşük dozlarda (1,000 mg/l) ekstraklar kök oluşumunu çok fazla etkilememiştir. 7,500 mg/l dozunda turp tohumu çimlenmesi bütün ekstraklar tarafından inhibe edilmiştir. Düşük dozlar (1,000 mg/l) çimlenmeyi azaltmıştır fakat bu yüksek dozlardaki kadar değildir. Etanolik ekstraklar tohum çimlenmesini diğer ekstraklardan daha fazla inhibe etmiştir. Anahtar Kelimeler: Verbascum thapsus L, sığır kuyruğu, in vitro kültür, HPLC, saponin, biyolojik test, antibakteriyal, antitümor, toksik, brine shrimp biyolojik testi, turp tohumu biyolojik testi. vııı

ABSTRACT AN IN VITRO CULTURE PROTOCOL, ANALYSIS OF SAPONIN AND BIOASSAY OF BIOLOGICAL ACTIVITY OF VERBASCUM THAPSUS L, A MEDICINAL PLANT Türker Uçar, Arzu Ph.D., Department of Biology Supervisor: Assoc. Prof. Dr. Ekrem Gürel June 2002, 127 pages Verbascum thapsus L. (common mullein) is a medicinal plant that has been used to treat pulmonary problems, inflammatory diseases, asthma, spasmodic coughs, diarrhea and migraine headaches. A reliable in vitro culture protocol for common mullein was established. Explants (leaf discs, petioles and roots) were cultured on Murashige and Skoog minimal organics (MSMO) medium with benzyladenine (BA) or kinetin (KIN). Best shoot proliferation was obtained from leaf discs and petiole explants with 3 mg/l BA. Leaf discs were cultured on MSMO medium with 3 mg/l BA in combination with naphthalene acetic acid (NAA) or 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). More shoot development was obtained with 3 mg/l BA and 1 mg/l NAA. Shoots were transferred to rooting media containing different levels of NAA or 2,4-D. Majority of shoots rooted on medium with 1 mg/l NAA.An extraction and analytical protocol for saponins was established for Verbascum thapsus L Four different kinds of plant sample were analyzed. Commercially obtained leaves had a higher concentration of saponin (0.215 mg/g tissue) than in vitro cultured and field-grown leaves (0.081 and 0.198 mg/g tissue, respectively) or the capsule samples (0.016 mg/g tissue). Biological activities of mullein extracts and commercial mullein products were assessed using selected bench-top bioassays. Bioassays included antibacterial, antitumor, and two toxicity assays (i.e., brine shrimp and radish seed bioassay). In general, aqueous extracts were the most effective and showed antibacterial activity against K. pneumoniae and S. aureus. Commercial products and purified saponins showed little or no antibacterial activity. Agrobacterium tumefaciens-induced tumors in potato tissue were inhibited by all mullein extracts, commercial products and purified saponins. Methanolic extracts of in vitro-grown leaves and commercially obtained leaves inhibited tumor formation better than the other extracts. Results of brine shrimp bioassay showed that extracts of mullein were toxic at higher doses (around 1,000 mg/l). Among aqueous extractions, decoctions had more toxicity (LC50 < 1,000 mg/l) than the infusion extracts. In radish seed bioassay, at high doses (10,000 mg/l), all extracts reduced the root length. However, at 1,000 mg/l, extracts did not affect the root length as much. Seed germination was also inhibited by mullein extracts at 7,500 mg/l. Low doses (1,000 mg/l) affected germination, but not as much as IVhigher doses. Ethanolic extracts inhibited seed germination more than other types of extracts. Keywords: Verbascum thapsus L, common mullein, in vitro culture, HPLC, saponin, bioassay, antibacterial, antitumor, toxic, brine shrimp bioassay, radish seed bioassay.