Investigation on the possible effect of proteases produced by aquatic microorganisms on Bacillus sphaericus neide crystal toxin proteins

Abstract

ÖZET SUCUL ORTAMLARDAKİ MİKROORGANİZMALRIN ÜRETTİĞİ PROTEAZLARIN BACILLUS SPHAERICUS NEIDE KRİSTAL TOKSİN PROTEİNLERİ ÜZERİNE OLAN ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI N. Canan Usta Ph.D., Biyoloji Bölümü Danışman: Prof. Dr. M. Tekin Babaç Mart 2003, 130 sayfa Bu çalışmada, Türkiye'deki bazı sivrisinek habitatlanndan 520 bakteri izole edildi ve bunların Bacillus sphaericus 2362 susunun sinek öldürücü toksini üzerine etkili olduğu sanılan proteolitik hücredışı proteazlan tarandı. Bir sonraki aşamada, saf bakteri kültürlerinin her biri nutrient broth sıvı besiyerinde büyütülerek hücredışı enzimleri elde edildi. Bundan sonra, toksin üzerine en etkili hücredışı proteazı/lan üreten bakteriyi bulmak amacı ile B. sphaericus toksini her bir isolatın hücredışı enzim solüsyonu ile muamele edildi. Bunun için, her bir izolatın enzim özütü spor solüsyonu halindeki B.s. toksini ile ependorf tüpleri içinde 24 saat süre ile inkübe edlerek sonrasında SDS-PAGE jeline uygulandı. Culex cinsinin 3. evre larvaları üzerine etkili olan Bs toksininin etkisini en çok azaltan 12 bakteri etkili olarak saptandı. B.s. toksini ve izolatlann hücredışı özütleri 12, 24 ve 48 saatlik 3 viayrı zaman süresi boyunca inkübe edildi ve inkübasyon süresinde B.s. toksini ile hücredışı enzimlerin etkileşmesinin sonucu gözlemlemek üzere SDS-PAGE jeline uygulandı. Sonuç olarak, toksinin etkisnin yok olması anlamına gelen ikili toksine ait jel üzerindeki her iki bandın birden kaybolması için 48 saatlik sürenin gerekli olduğu görüldü. Bununla birlikte, 24 saatlik süre sonunda bazı izolatlann B.s. toksininin etkisini 51 kDa'lık bandının jel üzerinde yok olması sonucunu doğurarak yan degredasyon yapabildiği ortaya çıkarıldı. Bu sonuçlar, aynı zamanda Culex cinsine ait larvalar üzerinde yapılan biyoessey deneyleri ile de doğrulandı. En çok etkili olan bu izolatlann hangi protein bileşenin bu etkiyi yaptığını ortaya çıkarmak üzere izolatlann hücredışı enzim özütleri native jelde koşturuldu. Her bir izolat içlerinden bir ya da birkaçının B.s. toksini üzerine proteolitik etki gösterebileceği yedi ile onbir arasında protein band profili ortaya çıkmıştır. Ortaya çıkan bu protein bantlarından gerçekte hangi(lerinin) etkili olduğunu belirlemek için her bir band B.s. toksini ile tekrar inkübe edilerek SDS-PAGE üzerinde tekrar koşturuldu. Sonuçta, en çok etkili izolatlardan bazılannın sadece tek bir etkili protein bandı ortaya çıkarmasının yanısıra bazılannn da birden fazla protein bandının aynı zamanda etkili olabileceği görüldü. 12 adet native-PAGE jelinde etiki görülen bantlardan ekstrakt edilen proteinlerinin moleküler ağırlığı belirlendiğinde 60-45 kDa aralığında bir yerde olduğu ortaya çıkanlmıştır. Bu çalışmanın sonuçlan böceklere patojen olan mikroorganizmalardan B. sphaericus' un binan toksinin her ikisinin birden sivrisinek habitatlanndan elde edilen bakterilerin hücredışı enzimleri ile inaktif hale getirildiğini ortaya çıkarmıştır. vııBu sonuç içerisinde B. sphaehcus susu bulunan larvasitlerin biyo-kontrol ajanı olarak kullanımında ortamın mikrobiyal içeriğinin de dikkate alınmasını gerektirir. Anahtar Kelimeler: Toprak bakteri izolatlan, Bacillus sphaericus 2362, sivrisinek larvası, Binari kristal toksin degredasyonu, PAGE, bioassay, proteaz. vm

ABSTRACT INVESTIGATION ON THE POSSIBLE EFFECT OF PROTEASES PRODUCED BY AQUATIC MICROORGANISMS ON BACILLUS SPHAERICUS NEIDE CRYSTAL TOXIN PROTEINS N. Canan Usta Ph.D., Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. M. Tekin Babaç March 2003, 130 pages In this study, 520 bacterial isolates from some mosquito habitats in Turkey were obtained and screened for their putative proteolytic extracellular protease(s) against Bacillus sphaericus (B.s.) strain 2362 mosquitocidal toxin. In the next step, bacterial isolates were grown in nutrient broth to obtain their extra-cellular proteases. After that, B. sphaericus toxin was treated by each of the extracellular mixture of the bacterial isolates in order to find out bacteria that produce the most toxin effective extra-cellular proteases. For this, each of the enzyme extracts from the isolates was incubated with toxin solution of the B.s. in eppendorf tubes for 24 hours that were later applied to the SDS-PAGE. A total of 12 organisms were detected as effective since they decreased the toxic effect of the Bs toxin tested on 3rd instar mosquito larvae of the genus Culex spp. Preparations of Bs toxin and isolates' extracts were mincubated in three different time course of 12, 24 and 48 hours and applied to SDS- PAGE in order to realize the effect of time on the interaction of the extra-cellular enzyme extracts and the B.s. toxin. It was found out that 48 hours period of incubation was necessary for total degradation of the binary toxin observed as the disappearance of both of the 51 and 42 kDa bands on corresponding SDS-PAGE gels. It was also observed that 24 hours of incubation period was enough for some of the bacterial proteases to half-degrade Bs toxin observed as the disappearance of the 5 1 kDa part of it on the gels. These results were as well confirmed by bioassays made on the larvae of field collected Culex spp. In order to discover the toxin inactivating proteolytic enzyme(s), extra-cellular enzyme mixture of bacterial isolates were applied to Native-PAGE. Each of the isolates produced seven to eleven protein bands some of which might be responsible for the degradation of the Bs toxin. To further determine which ones of these protein bands were actually affecting and/or degrading the toxin, each band was separately treated with the Bs toxin and analyzed on SDS-PAGE. It was found out that some of the effective isolates had only one protein band at around 45 kDa range on SDS-PAGE in common, while the rest of the isolates have one or two bands around the same region. When the molecular weights of the toxin inactivating proteins were determined it was found out that it was a protein of molecular weight around 45 kDa. Our results presented in this thesis indicate that both of the protein subunits of entomopathogenic B. sphaericus strain 2362 can be degraded at the same time by the extra-cellular proteolytic activity of bacteria of the genus Bacillus isolated from aquatic mosquito environments. This result necessitates that microbial content of the ivmosquito habitats should be taken into account when bio-control agents such as B. sphaericus formulated larvicides is to be used. Keywords: Soil bacterial isolates, Bacillus sphaericus 2362, Mosquitoe larvaes, Binary Crystal Toxin degradation, PAGE, bioassay, protease.