Siyalik asitin trombosit fonksiyonları ve kriyoprezervasyonuna etkisi

Abstract

ÖZET: Kan ve kan ürünlerine maruz kalan kişilerde yüksek oranlarda trombositlere karşı alloimmünizasyon gelişmesi ve takip eden transfüzyon desteği ile ciddi olarak etkileşmesi, HLA ve HPA uygun trombosit transfüzyonlarının bir dereceye kadar başarılı olmasına karşın, uygun donör kayıtlarına sahip büyük organizasyonlara gereksinim göstermesi, buna karşın taze olarak hazırlanan trombositlerin raf ömrünün bakteriyel kontaminasyon riski nedeni ile 5 günle sınırlı olması, trombosit saklama yöntemlerinin geliştirilmesini güncel bir gereksinim olarak devam ettirmektedir. Kriyoprezervasyon ile trombositler 2 yıla dek saklanabilmekte, ancak fonksiyon ve viyabiliteleri üzerinde istenmeyen etkiler ortaya çıkmaktadır. Trombositler aktive olmakta, net yüzey negatif yükleri ve siyalik asit içeriklerinde azalma ortaya çıkmaktadır. Biz de çalışmamızda trombositlerin aktivasyona uğrayarak yaşamsal ve fonksiyonel kayba gitmelerini engellemeye yönelik bir yöntem geliştirmeyi amaçladık. Çalışmada kullanılan trombosit konsantreleri ve otolog plazma, aferez yöntemi ile sekiz donörden elde edildi. Siyalik asit içermeyen taze trombosit konsantrelerinde ortalama p-selektin ekspresyonu %3.83 ± 4.39 idi. Yaptığımız ön çalışmada taze trombosit konsantrelerine artan oranda eklenen siyalik asitin, siyalik asit eklenmeyen trombosit konsantreleri ile karşılaştırıldığında, en belirgin 4 mg/ml konsantrasyonda olmak üzere, doza bağımlı olarak ADP ile indüklenen agregasyon yanıtını engellediğini ve ADP ile indüklenen p-selektin ekspresyonunu etkin biçimde azalttığını gözledik (R= -0.55 ve p= 0.001). Bu gözlem bizi, trombosit konsantrelerine %5 DMSO'ya ek olarak 4mg/ml konsantrasyonda siyalik asit eklenmesinin kriyoprezervasyon sürecine bağlı trombosit aktivasyonunu azaltıp azaltmayacağını araştırmaya yöneltti. Kriyoprezervasyon, kontrol grubu (%5 DMSO içeren grup) trombositlerin p-selektin ekspresyonunu istatistiksel olarak anlamlı oranda arttırmadı (%5.62 ± 1.14). Ancak, beklemediğimiz biçimde, %5 DMSO'ya 4 mg/ml konsantrasyonda siyalik asit eklenerek kriyoprezervasyon uygulaması(siyalik asit grubu), trombositlerin p-selektin ekspresyonunda, kontrol grubuna kıyasla belirgin daha fazla bir artışa yol açtı (%26.37 ± 3.25). Kriyoprezervasyon, kontrol grubu trombositlerin GP Ib ekspresyonunu azalttı (p<0.02), ancak bu azalma çok düşük düzeyde idi (%2.14). 4 mg/ml siyalik asit ve %5 DMSO ile kriyoprezervasyon uygulanan trombositlerin GP Ib ekspresyonu, kontrol grubuna benzer bir azalma gösterdi. Kriyoprezervasyon sonrasında kontrol grubu ve siyalik asit içeren trombositlerin ortalama trombosit hacmi arttı (sırası ile %6.85 ± 1.18 ve p<0.02, %6.1 ± 0.29 ve p<0.02). Kriyoprezervasyon sonrası yıkama işlemi uygulaması, kontrol grubu trombositlerin p- 53selektin ekspresyonunu belirgin oranda artırırken (%26.59 ± 4.50 ve p<0.05), her iki grubun GP Ib ekspresyonunda da belirgin bir azalmaya neden oldu (sırası ile %86.96 ± 7.51 ve p<0.05, %87.42 ± 3.72 ve p<0.05). Kriyoprezervasyon, kontrol grubu trombositlerin ristosetin ve ADP'ye karşı yanıtını anlamlı düzeyde bozdu. Her ne kadar siyalik asit, oda ısısında ADP tarafından indüklenen agregasyon ve aktivasyonu engelleyebiliyor olsa da kullanışlı bir kriyoprotektif ajan değildir. T.G yj&BSKKftfiREIftl KUMDU» MÜEDBIANTASYON MEEKEZ? 54

SUMMARY: Platelet transfusions have been ineffective in patients who developed alloimmunization to platelet antigens. In the patients, who are refractory to platelet transfusions, cryopreserved otologous platelets may be the only alternative to control bleeding and the risk of hemorrhage. Altough platelets can be stored for up to two years, cryopreservation causes undesirable effects on platelet functions and viability; activates platelets and induces loss of sialic acid and net negative surface charge. In this study, to develop a new method of platelet cryopreservation that could prevent platelet activation was aimed. Platelet and otologous plasma samples utilized in this study were obtained by apheresis. Mean p-selektin expression of fresh platelets which did not contain sialic acid was 3.83 ± 4.39 %. In the first part of the study, we found that addition of sialic acid to platelet concentrates was preventing ADP induced platelet aggregation and was suppressing ADP induced p-selectin expression, in a dose dependent manner (R= -0.55 and p= 0.001). The most impressive results were obtained with 4mg/ml sialic acid concentration. We planned to study whether sialic acid could prevent cryopreservation induced p- selectin expression. But, unexpectedly, p-selectin expression of platelets which were cryopreserved with 4mg/ml sialic acid + 5 % DMSO (sialic acid group) was significantly higher than the control group (26.37 ± 3.25 % and 5.62 ± 1.14 %, respectively). Cryopreservation induced p-selectin expression increase of control platelets was not statistically significant (p<0.05). Cryopreservation induced a little but, statistically significant dicrease in GP lb expression of control and sialic acid group (96.55 ± 0.69 % and 96.67 ± 0.73, p<0.02, respectively). Cryopreservation induced a decrease in response to ristocetin and ADP in control group platelets and induced a decrease in response to ristocetine in sialic acid group platelets. Cryopreservation caused a volume increase in control and sialic acid group platelets. After washing, GP lb expression of control and sialic acid group platelets decreased (86.96 ± 7.51 % and 87.42 ± 3.72, respectively) significantly. Washing step induced a significant increase in p- selectin expression of control platelets (26.59 ± 4.50 % and p<0.05). We concluded that although addition of sialic acid to fresh platelet concentrates has prevented ADP induced aggregation and activation of platelets at room temperature, sialic acid was not a usefull cryoprotective agent. Key Words: Platelet, cryopreservation, sialic acid, 5 % DMSO, apheresis, p-selectin expression, GP lb expression 52