Astroglial hücre kültüründe eritropoietin ve interlökin-1 B`nin NGF ve nitrik oksid üretimi üzerine in vitro etkileri

Abstract

66 ÖZET Santral sinir sisteminin bir çok patolojik durumu nöronların kaybı sonucu oluşmaktadır. Nöronlara destek sağlanması ve nöronların yaşam ömrünün uzatılması, SSS'nin yapısal bütünlüğünün ve fonksiyonlarının korunmasını sağlayacaktır. Santral sinir sistemin'deki hücre populasyonunun çoğunu oluşturan astrositler, nöronların gelişiminde ve SSS hasarının onarım sürecinde önemlidir. Astrositler ürettikleri büyüme faktörleri ile nöronlara yaşam desteği sağlamaktadır. Büyüme faktörlerinden bir kısmı nörotrofik etkili olup bu grubun en iyi bilineni NGF'dir. Nerve Growth Factor, SSS'de özellikle bazal ön beyin kolinerjik nöronlarının yaşam süresini arttırmaktadır. Santral sinir sisteminde glial hücrelerden sentezlenen NO, sinaptik iletim, nörotoksisite, nöronal şekillenme ve gelişimde etkili olan düzenleyici bir gazdır. Nitrik Oksid çok kısa ömürlü olduğu için ortamdaki varlığı metabolitleri olan nitrit ve nitrat düzeyleri ile saptanmaktadır. Eritropoietin, SSS'de nöron koruyucu etkisi yeni keşfedilmiş olan hematopoetik bir büyüme faktörüdür. İL- ip ise hücrelerin farklılaşması ve aktivasyonu ile lokal immun yanıtın gelişiminde önemli bir role sahip olan inflamatuar bir sitokindir. Santral sinir sisteminde astroglial hücreler EPO ve İL- ip üretirler. Bu hücreler aynı zamanda EPO ve İL- ip reseptörlerine de sahiptirler. Lipopolisakkarid bakteriyel bir antijendir. Bazı çalışmalarda LPS'in astroglial hücre kültüründen NGF salmımını arttırdığı bildirilmiştir. Çalışmamızın amacı, astroglial hücre kültüründe EPO, IL-ip ve LPS'in NGF ve NO'nun metabolitleri olan nitrit ve nitrat üretimi üzerine in vitro etkilerini incelemektir. Bu deneysel çalışmada dokuz adet fare astroglial hücre kültürü grubu oluşturulmuştur. Bu gruplar sırasıyla 1. Kontrol grubu (n=3), 2. EPO 0.1 U/mL (n=3), 3. EPO 1 U/mL (n=3), 4. EPO 5 U/mL (n=3), 5. İL- ip 10 ng/mL (n=3), 6. İL- ip 5 ng/mL (n=3), 7.IL-lp 1 ng/mL (n=3), 8.IL-lp 0.1 ng/mL (n=3) ve 9. LPS 1 ug/mL (n=3)'dır. Astrosit kültürünün oluşturulmasında yenidoğan sıfınncı gününde 8 tane BALB/c fare beyni kullanılmıştır. Mekanik ayırımın ardından %10 fetal bovin serumu içeren DMEM/F12 ortamı içinde polilizin ile kaplı kültür kaplarına ekim yapılmıştır. Glial hücrelerin kültür kabına farklı yapışma özelliklerine dayanan shaking yöntemiyle saf astrosit kültürü yapılmıştır. Astrositler kültür kabının en altında67 gelişmektedirler. Kültürün 10. gününde shaking işlemi ile mikst glial kültürden mikroglial hücrelerin ve oligodendrosidlerin ayrımı yapılarak kültürde bulunan hücreler ile astroglial hücre kültürü oluşturulmuştur. Astroglial kültürlerin saflığı astrositlere özgü GFAP ile kontrol edilmiştir. Daha sonra in vitro deneye geçilmiştir. 24 well plaklara ekim yapılmış astrositlere EPO, İL- 1(3 ve LPS eklenmesinden 24 saat sonra süpernatanlar alınarak NGF ve NO metabolitleri olan nitrit ve nitrat miktarları ölçülmüştür. NGF düzeyleri ELISA kiti (Promega NGF Emax ImmunoAssay System,Katalog No G7630, Promega Corporation,USA) ile belirlenmiştir. Nitrit ve nitrat düzeyleri ise sırasıyla Griess ve Bories yöntemleri kullanılarak saptanmıştır. EPO ile uyarılan astroglial kültür grupları hiçbir maddenin eklenmediği kültürlerin oluşturduğu kontrol grubu ile karşılaştırıldığında NGF ve NO metabolitleri düzeyi bakımından farklılık göstermemiştir. IL-ip'nın 1 ng/mL grubu ise NGF (p=0.000), total NO (p=0.04) ve nitrat (p=0.04) düzeyleri bakımından kontrol grubuna döre anlamlı olarak yüksek bulunmuştur. LPS'in 1 ug/mL dozu literatürle uyumlu olarak kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı yüksek (p=0.05) bulunmuştur. Bu çalışma EPO'nun uygulanan dozlarda fare astrositlerinden NGF salgılanmasını ve total NO düzeylerini değiştirici etkisinin bulunmadığını göstermiştir. IL-ip 1 ng/mL dozunda astroglial kültürlerin NGF, nitrat ve total NO düzeylerini anlamlı olarak arttırmıştır. Ayrıca LPS 1 (ig/mL düzeyleri de NGF salınımım arttırmıştır. Çalışmamız İL- ip 1 ng/mL dozunda astroglial hücrelerden nöronal hayatta kalım için önemli olan NGF üretimini arttırdığını göstermektedir. Çalışmamızın diğer bir sonucu da IL-ip'nın yine aynı dozda, astroglial hücrelerden, SSS'nin infeksiyonlara karşı savunmasında etkili olan ve inflamasyonda nöronal hasardan sorumlu tutulan NO sentezini arttırmasıdır. Sonuç olarak astroglial hücreler İL- ip ile oluşturulan inflamasyona iki tür yanıt vermektedirler. Bunlardan biri nöronal hasardan sorumlu olabilecek NO sentezini arttırmaları diğeri ise nöronların hayatta kalımını destekleyen NGF üretimini arttırmalarıdır. /nahtar Sözcükler; Nerve Growth Factor (NGF), Eritropoietin (EPO), tnterlökin -ip (IL-ip), Nitrik Oksid TMO), Lipopolisakkarit (LPS), Santral Sinir Sistemi (SSS)