Astrosit hücre kültüründe bilirubinin neden olduğu apoptotik ve nekrotik hücre ölümünün değerlendirilmesi

Abstract

ÖZET Yüksek serum bilirubin konsantrasyonu ile ilişkili klinik ensefelopati ve santral sinir sisteminde belirli bölgelerde sarı boyanma olarak gözlenen önemli patolojik değişikler arasındaki ilişki 1875 gibi çok erken dönemlerde tanımlanmıştır. Buna rağmen, günümüzde hala bilirubin nörotoksisitesi için, temel mekanizmayı neyin oluşturduğu sorusuna hala cevap aranmaktadır Bilirubin sitotoksisitesi, astrositler ve nöronları da içeren değişik hücre tiplerinde gösterilmiştir. Beyin kapillerlerinin bariyer özellikleri astrositler tarafından oluşturulmaktadır. Bu hücreler hormonlar ve nutrientlerin beyne transportunda önemli rol oynarlar. Bu nedenle astrositler, KBB yetersizliğinde bilirubin ile ilk temas eden hücreler olabilir. Bilirubin ensefelopatisinde astrositlerin rolü büyük oranda ihmal edilmiştir. Astrositler, insanlarda beyin korteksindeki total hücresel volumün yaklaşık olarak üçte birini kapsar. Bu özellikleri nedeniyle, bilirubinin neden olacağı biyokimyasal hasarın gösterilmesinde, astrosit kültürü diğer modellere katkı sağlamaktadır. Astrosit hücre kültüründe yaptığımız bu çalışmada, hiperbilirubinemili hasta serumu çok daha düşük bilirubin konsantrasyonlarında, kültür ortamına doğrudan eklenen bilirubinden daha fazla sitotoksisiteye neden olduğunu ve inaktive edilmemiş hasta serumunun inaktive edilmiş serum örneğine göre daha fazla sitotoksisiteye yol açtığını gördük. Bu çalışmanın sonuçları gerek indirek hiperbilirubinemili hasta serumunun gerekse bilirubinin astrosit kültürlerinde doza ve zamana bağlı sitotoksisiteye yol açtığını göstermektedir. İndirek hiperbilirubinemili hasta serumunun astrosit üzerine toksik etkisi ilk kez bu çalışmada araştırılmıştır. Bu çalışma aynı zamanda bilirubinin fere astrositleri üzerine toksik etkisinin gösterildiği ilk çalışma özelliğini de taşımaktadır. Bu çalışmada gerek indirek hiperbilirubinemili hasta serumunun ve gerekse bilirubinin astrosit kültürlerinde apoptotik hücre ölümünü indükleyip indüklemediği de araştırılmıştır. Sonuçlar hem hasta serumunun hem de bilirubinin doza ve zamana bağımlı astrosit apoptozuna yol açtığım göstermektedir. Bu tez çalışması indirek hiperbilirubinemili hasta serumunun apoptotik astrosit ölümüne yol açtığını gösteren ilk çalışmadır. Ayrıca ilk kez bu çalışmada bilirubinin fere astrositlerinin apoptotik ölümünü indüklediği gösterilmiştir. Apostain immünfloresan boyama sonuçlan gerek hasta serumunun gerekse bilirubinin astrosit kültürlerinde doza bağımlı apoptotik hücre ölümüne yol açtığım göstermektedir. LDHsonuçlarına benzer biçimde bilirubinin apoptotik hücre ölümünü indükleyici etkisi 48. saatte 72. saattekinden daha belirgin bulunmuştur. Sonuç olarak bu çalışmada indirek hiperbilirubinemili hasta serumunun ve bilirubinin yenidoğan fare astrosit kültüründe doza ve zamana bağımlı olarak sitotoksik ve apoptotik hücre ölümünü indüklediği gösterilmiştir. Anahtar kelimeler : indirek bilirubin, astrosit hücre kültürü, apoptozis, sitotoksisite

SUMMARY As early as 1875 it was established that there is an association between high serum bilirubin levels and clinical encephalopathy characterized by yellowish staining of certain central nervous system sites on pathological examination. However, even today the mechanism underlying the bilirubin neurotoxicity is not fully understood. Bilirubin cytotoxicity has been demonstrated in different cell types, including astrocytes and neurons. Astrocytes form the barrier function of the brain capillaries. These cells comprise about one-third of the total cellular mass in the human brain cortex, astrocytes also play a vital role in the transport of hormones and micronutrients into the brain. Therefore, astrocytes may be the first line cells that come in contact with bilirubin when the blood-brain barrier fails. Their role in the development of bilirubin encephalopathy has not been fully investigated. Astrocyte cell cultures may contribute to other models in the demonstration of bilirubin neurotoxicity. In this study performed on astrocyte cell cultures we demonstrated that serum from patients with hyperbilirubinemia caused more cytotoxicity then bilirubin added directly to the culture media, even when the level of bilirubin in the serum was much less then the directly added bilirubin. Also, inactivated serum samples caused less cytotoxicity then not inactivated samples. Results of the current study show that both serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin itself causes cytotoxicity in astrocyte cell cultures. This study for the first time shows that serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin itself have cytotoxic effects on rat astrocytes. The study also tried to identify whether serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin directly caused apoptotic cell death in astrocyte cell cultures. The results show that both serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin lead to dose and time dependent apoptosis in astrocytes. This thesis is the first study showing that serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin itself induce cell death via apoptosis. Apostain immunofluorescent staining showed that both patient serum and bilirubin lead to dose dependent cell death by apoptosis in astrocyte cell cultures. Similar to the effect of LDH, bilirubin caused most of its cytotoxic effect within 48 hours.In conclusion, serum from patients with indirect hyperbilirubinemia and bilirubin directly induce dose and time dependent apoptotic cell death in newborn rat astrocyte cell cultures. Keywords: indirect bilirubin, astrocyte cell culture, apoptosis, cytotoxicity