Gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi ile HBV DNA kantitasyonu ve HBV DNA YMDD motif mutasyonu analizi

Abstract

1. ÖZET Gerçek zamanlı polimeraz zincir tepkimesi ile HBV DNA kantitasyonu ve HBV DNA YMDD motif mutasyonu analizi Dr. Harun Ağca Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji A.D. İnciraltı/ İzmir Anahtar sözcükler: HBV, lamivudin direnci, YMDD, gerçek zamanlı PZT, erime ısısı Hepatit B virusu, dünya nüfusunun üçte birinin karşılaştığı önemli bir sağlık sorunu etkenidir. Etkenle yenidoğan döneminde karşılaşanların %90'da, erişkin yaşta karşılaşanların % 5-10'unda kronik infeksiyon gelişmekte ve bu hastalar siroz, hepatosellüler karsinom gibi komplikasyonlar açısından yüksek risk taşımaktadırlar. Nükleozit analogları, kronik B hepatiti tedavisinde kullanılan ajanlar arasında önemli bir yer tutmaktadır. Günümüzde bu grup içerisinde en yaygın kullanılan ilaç lamivudindir. Ancak lamivudin ile tedavi sırasında viral polimeraz geninde yer alan ve enzimin YMDD motifinin ikinci aminoasidinde değişikliğe yol açan mutasyonlar gelişerek ilaca karşı dirence yol açmaktadır. Lamivudine direnç gelişmesi, tedavi başarısızlığına ve karaciğer hasarında alevlenmeye yol açmaktadır. Bu nedenle lamivudin kullanan hastalarda direnç gelişiminin izlenmesi ve gereğinde ilaç değişikliğine gidilmesi önerilmektedir. Lamivudin direncinin genotipik yöntemlerle belirlenmesinde, sıklıkla, dizi analizi, LIPA yöntemi, restriksiyon enzim fragman analizi (`RFLP`) ve gerçek zamanlı PZT yöntemleri kullanılmaktadır. Çalışmamızın amacı, aynı testte HBV DNA kantitasyonu ve YMDD motif analizini sağlayacak gerçek zamanlı PZT yöntemi geliştirilmesidir. `Bi-probe` yöntemine dayalı gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizi kullanılmıştır. Bu amaçla bir adet Cy5 ile işaretli hibridizasyon probu kullanılmış ve PZT karışımına SYBR Green boyası eklenmiştir. Testin optimizasyonu ve yabanıl / mutant viruslara özgü erime ısılarının belirlenmesinde YMDD, YVDD, 1YIDD motifleri ile uyumlu diziler taşıyan klonlanmış ürünler kullanılmıştır. Erime ısısı analizi, prob üzerindeki Cy5 boyası ile çift sarmala bağlanan SYBR Green arasındaki enerji transferine (`Flourescent resonance energy transfer` FRET) dayalıdır. YMDD, YIDD ve YVDD için elde edilen farklı erime tepe noktalan (Tm), yabanıl / mutant dizilerin ayırd edilebilmesini sağlamıştır. Gerçek zamanlı PZT ile HBV DNA kantitasyonu için kalite kontrol serumlarına (VQC, Hollanda) dayalı eksternal kantitasyon eğrisi yöntemi kullanılmış ve testin kantitasyon aralığı 3x1 03 ile 3xl07 kopya/ml olarak belirlenmiştir. Geliştirilen testin, serum örnekleri ile değerlendirilebilmesi için Dokuz Eylül Üniversitesi Hastanesi'nde kronik B hepatiti nedeniyle izlenen ve lamivudin kullanmakta olan yirmi bir hastaya ait otuz dokuz serum örneği incelenmiştir. Örneklerdeki YMDD motif dizisi ticari LIPA testi ve dizi analizi ile belirlenmiştir. Aynı örnekler, geliştirilen gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizi ile de incelenerek, erime ısısı analizinin diğer iki yöntemle uyumu değerlendirilmiştir. Ortalama erime tepe noktası ışılan, YMDD için 59.29 °C, YVDD için 55.11 °C, YIDD için 52.91 °C olarak belirlenmiştir. Yöntemde kantitasyonun alt sının olan 3000 kopya/ml seviyesinin üzerinde HBV DNA içeren örneklerde YMDD motif mutasyonu saptama açısından duyarlılık, dizi analizine göre değerlendirildiğinde % 88, LIPA yöntemine göre değerlendirildiğinde % 83 olarak belirlenmiştir. Örneklerdeki HBV DNA kantitasyonu ticari bir test (RealArt HBV DNA RG, Artus, Almanya) ve geliştirilen gerçek zamanlı PZT ile yapılmış ve sonuçlar birbiri ile uyumlu bulunmuştur. Geliştirilen gerçek zamanlı PZT ve erime ısısı analizinin, duyarlılığı yüksek, minör virus populasyonlan dışında LIPA ve dizi analizi ile uyumlu, kolay uygulanabilir, hızlı, ekonomik ve YMDD mutasyon analizi ile HBV DNA kantitasyonunu aynı çalışmada belirleyebilen bir yöntem olduğu belirlenmiştir. Yöntemin geliştirilebilir yönleri olmakla birlikte HBV DNA kantitasyonu ve YMDD mutasyon analizi yapan, örnek sayısı yüksek laboratuvarlarda kullanıma uygun olduğu düşünülmektedir.

2. SUMMARY Quantification of HBV DNA and analysis of HBV DNA YMDD motif mutation by real-time polymerase chain reaction Dr. Harun Ağca Dokuz Eylul University Faculty of Medicine Microbiology and Clinical Microbiology Department tnciraltı/ İzmir Keywords: HBV, lamivudine resistance, YMDD, Real-Time PCR, melting temperature Hepatitis B virus, which has infected one third of the world population, is a major health problem. HBV infection may progress to chronic hepatitis in 5-10 % of infected adults and 90% of the infected newborns. Patients with chronic hepatitis B infection are under the risk of developing cirrhosis and/or hepatocellular carcinoma. Nucleoside analogs are an important group of drugs used for the treatment of chronic hepatitis B. The most commonly used drug in this group is lamivudine. During lamivudine treatment, mutation in the second aminoacid of the YMDD motif, which is located in the polymerase region of HBV DNA, leads to drug resistance. Resistance to lamivudine causes treatment failure and worsening of hepatic injury. Therefore, monitoring the patients for drug resistance during lamivudine treatment and changing the antiviral agent when necessary are recommended. Frequently used genotypic methods for the determination of drug resistance are sequence analysis, line probe assay (LIP A), restricted fragment length polymorphism (RFLP) and real-time PCR. The aim of the study was to develop a real-time PCR assay that could quantify HBV DNA and detect YMDD motif mutations in the same run. The assay was developed using the `bi-probe`method, which required a single Cy5 linked hybridization probe and SYBR Green added PCR mix. Plasmids cloned with a fragment of HBV DNA with YMDD, YVDD and YIDD motif specific sequences were used for optimization of the assay. Determination of YMDD motif mutations was based on melting temperature (Tm) analysiswhich was detected by fluorescent resonance energy transfer (FRET) between the Cy5-labelled probe and SYBR Green. It was possible to determine the YMDD motif since melting peaks converted from the melting curves were different for YMDD, YIDD and YVDD sequences. Quality control sera (VQC, Netherlands) were used to generate a standard curve for the quantification of HBV DNA. Quantification range was between 3x1 03 and 3xl07copies/ml. Thirty-nine serum samples of 21 chronic B hepatitis patients who had been treated with lamivudine in Dokuz Eylül University Hospital were tested by the developed real-time PCR assay. The YMDD motif mutations of these sera were also evaluated by sequence analysis and line probe assay (LIP A). The results of the melting peak analysis were compared with the results of sequence analysis and LIP A. The average melting peak temperature was 59,29 °C for YMDD, 55,1 1°C for YVDD, and 52,91 °C for YIDD. The sensitivity of the melting peak analysis for the detection of YMDD motif sequence was 88 % against sequence analysis and 83 % against LIP A, when sera containing > 3000 copies/ml were taken into consideration. HBV DNA quantification results of the developed real time PCR assay were in concordance with the results of the commercial real-time PCR kit (Real-Art HBV RG, Artus, Germany). In conclusion, the developed method is sensitive, easy to perform, rapid and inexpensive. When compared with LIPA and sequence analysis, the results are similar for the samples except for those containing minor viral populations with low viral load. The test can also perform quantification and mutation analysis at the same run. Although the method may be developed further, it is suitable for centers which have high patient turnover.