Ekstrasellüler matriks proteinleri : Nidogen ve fibronektin. moleküler yapılarının biyolojik fonksiyonlar üzerine etkileri

Abstract

1. ÖZETLER 1. 1. Özet Anahtar Kelimeler: Rekombinant protein ekspresyonu, Nidogen, Fibronektin, Ekstrasellüler matriks, Keratinosit, Fibroblast, İki yönlü jel elektroforezi, Malign transformasyon, Terminal diferansiyasyon. Başlık: Ekstrasellüler matriks proteinleri: Nidogen ve fibronektin. Moleküler yapılarının biyolojik fonksiyonlar üzerine etkileri. Araştırmacı: Dr. Yasemin BASKIN ECM proteinleri, dokularda yapısal fonksiyonları yanında, gen aktivitesinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olarak hücre yaşamının düzenlenmesinde aktif rol oynarlar. Etkilerini integrinlerle hücre iskeletini ve sinyal aktarım yollarını etkileyerek gösterirler. Çalışmamızda, ECM proteinlerinden fibronektin ve nidogenin fonksiyonlarını araştırdık. pFN' ni afinite kromatografisi ile saflaştırdık. Nidogen ve fragmanlarını, E. coli ' de pGEX vektör sistemiyle eksprese ederek, HPLC, afinite kromatografisi, vb. ile saflaştırdık. Deney modelini insan derisinin temel hücreleri olan keratinosit ve fibroblastlarda oluşturduk. Dermal fibroblast, epidermal keratinosit, MRC5, HaCat serileri normal hücre fonksiyonlarını, SVK14, MRC5SV40 malign hücre fonksiyonlarını araştırmak için kullanıldı. GST gen füzyon sistemi, nidogen için modifiye edildi. Normal keratinositlerin kültüre edilebilmeleri ve yaşayıp çoğalabilmeleri için ECM proteinlerinin gerekliliği, protein miktarı ile tutunmanın arttığı, aktin ve vimentin liflerinin organize olmasını sağladığı gösterildi.FN ve nidogen tek olarak hücre proliferasyonunu uyarırken dermal ekstrakt daha kontrollü bir büyüme sağlamaktadır. Keratinositlerde proliferasyon göstergesi olan psöriasin mRNA' sında görülen benzer artış da bulgumuzu desteklemektedir. Divalent katyonlar doza bağımlı olarak ECM proteinleri ile integrin bağlanmasını düzenlemektedirler. Yüksek kalsiyum oranlarında en fazla inhibisyon dermal ekstrakta tutunma sırasında gözlenmiştir. Keratinositlerde, erken dönemde, terminal diferansiyasyonun ECM proteinlerince geciktirildiği gösterilmiştir. Malign transformasyonda, hücrenin protein içeriği değişmektedir. Immun aktivasyona yanıt olarak artan psöriasinin transforme hücrede azalması, malign hücrelerin immun sistemden korunabildikleri yönündeki hipotezi destekler görünmektedir. Bu çalışma, Dokuz Eylül Üniversitesi Rektörlüğü, Araştırma Fon Saymanlığı ( proje no: 0923 94 01 02) ve TÜBİTAK- BAYG (Nato Science Fellowship Programı, burs no: B 02 1 Bak 0 09 00 00 94-3680) tarafından desteklenmiştir.

1. 2. Summary Key Words: Recombinant proteins, Nidogen, Fibronectins, Extracellular matrix, Keratinocytes, Fibroblast, 2 D Gel Electrophoresis, Malignant transformation, Terminal differentiation. Title: Extracellular matrix proteins: Nidogen and fibronectin. Effects of molecular structures on biological functions. Research Fellow: Dr. Yasemin BASKIN Extracellular matrix (ECM) proteins play an active role in regulation of cell life by changing protein expression, gene activity, and structural functions in tissues. ECM proteins show their effects via integrins by affecting cell skeleton and signal transporting pathways inside cells. Fibronectin (FN) and nidogen functions were studied as the members of ECM proteins. pFN was purified by affinity chromotography. Nidogen and fragments were expressed by pGEX vectors in E. coli and purified by HPLC and affinity chromotography etc.. Experimental model was prepared with keratinocytes and fibroblasts that are basic cells of human skin. Dermal fibroblasts, epidermal keratinocytes, MRC5 and HaCat cell lines were used in studying normal cell functions, SVK14, MRC5SV40 malignant cell functions. GST gene fusion system was modified for nidogen. We showed the necessity of ECM proteins in normal keratinocyte cultures; increasing the protein amount increases the attachment, and the protein amount makes sure the organization of actin and vimentin fibers. We showed FN and nidogen stimulates cell proliferation in their own, at the same time dermal extract makes sure the growth in a controlled manner.Similar increase in psoriasin mRNA which is a sign of proliferation in keratinocytes supports our findings We showed that divalent cations regulate the binding of ECM proteins and integrins in a dose dependent manner. We found that in high calcium concentrations the highest inhibition was during attachment on dermal extract. And also we showed that in early stage, ECM proteins can inhibit terminal differentiation of keratinocytes. As a result, in malignant transformation the protein content of cells can change. The psoriasin upregulates in immune activation, on the contrary downregulates in transformed cells. This result seems to support the hypothesis which explains the defence system of malignant cells against immune system. This work was supported by University of Dokuz Eylül, Scientific Grant ( 0923 94 01 02) and a NATO-Science fellowship to Dr. Yasemin Baskın from the TUBİTAK-BAYG ( B. 02. 1. Bak. 0.09.00 00. 94-3680).