Penisiline dirençli streptococcus pneumoniae suşlarının moleküler epidemiyolojisi

Abstract

ÖZET Penisiline Dirençli Streptococcus pneumoniae Suşlarının Moleküler Epidemiyolojisi Meral Biçmen Streptococcus pneumoniae (S. pneumoniae) tüm dünyada toplum kökenli pnömoninin en önemli etkenidir. Ülkemizde penisiline dirençli Streptococcus pneumoniae suşlarının moleküler epidemiyolojisi hakkında yeterli veri bulunmamaktadır. Bu tez çalışmasında; Kasım 1999 ve Ocak 2001 tarihleri arasında yedi farklı merkezden izole edilen toplam 110 Streptococcus pneumoniae susunun klonal ilişkisi araştırıldı. Penisilin (P) ve eritromisin (E) MİK değerleri E-Test, sefotaksim (CTX) MİK değerleri ise E-test veya mikrodilüsyon yöntemiyle belirlendi. Diğer ajanların duyarlılıkları; klindamisin (CC), tetrasiklin (TE), kloramfenikol (C), trimethoprim sulfamethosazol (TMP-SMX), siproloksasin (CİP) ve levofloksasin (LEV) duyarlılıkları disk difüzyon yöntemiyle çalışıldı. Kapsül serotipleri koaglütinasyon ve kapsül şişme tepkimesi ile araştırıldı. Suşların kendi aralarındaki klonal ilişkileri ve Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN) tarafından tanımlanmış 16 penisilin dirençli klon ile benzerlikleri BOX-A1R primeri kullanılarak BOX-PCR yöntemiyle incelendi. Ayrıca PBP1a, PBP2b ve PBP2x REA paternleri belirlendi. Tüm grubu temsilen seçilen 21 susun [sekiz penisiline yüksek düzey dirençli (PenR), dokuz penisiline düşük düzey dirençli (Pen1) ve dört penisiline duyarlı (Pens)] PBP1a, PBP2b ve PBP2x genlerinin nükleotid dizi analizi yapıldı. Analizler sonucunda, suşlardan 10'u (%9.1) PenR, 80'i (%72.7) Pen', ve 20'si de (%18.2) Pens bulundu. CTX, E, CC, TE, C ve TMP-SMX için direnç oranlarının sırasıyla %0.9, %29.1, %29.1, %27.3, %18.2 ve %76.4 olduğu belirlendi. Genel olarak, penisilin yüksek düzey dirençli suşlar genellikle diğer antibiyotiklere de dirençli bulunurken, penisilin duyarlı ve dirençli izolatlar arasında kinolon direncine rastlanmadı. Penisiline dirençli suşların kapsül serotipleri incelendiğinde, 23, 14, 19, 9V, 6B ve15B serotiplerinin en yaygın olarak izole edilen serotipler olduğu gözlendi. Streptococcus pneumoniae R6 susunun sekansı ile karşılaştırıldığında, Penm izolatlarının nükleotid ve peptid sekanslarının sırasıyla %14.9 ve %8.5 oranında farklı olduğu saptandı, pbp sekanslarına göre filogenetik ağaçlar oluşturuldu ve ülkemiz izolatlarının çoğu Gen-Bank sekanslarından farklı olarak ayrı bir dalda beraberce kümelendiği gözlendi. PenT izolatların PBP1a sekanslarında, en sık görülen değişim aktif bölgede bulunan STMK motifindeki T371A mutasyonu idi. Tüm izolatlarda aynızamanda TSQF yerine bir 574NTGY577 bloğu saptandı. Sırasıyla Penl/R izolatların %65 ve %86'sında, PBP2b sekanslarında T451A ve E481G mutasyonları saptandı. R6 QLQPT sekansının yerine, tüm izolatlarda 570 ve 574. aminoasitler arasında bir SVESK/TK bloğu gözlendi. pbp2x genlerinin araştırılması sonucunda, izolatların %71'inde STMK motifinde T338A mutasyonu bulundu. Üç izolatta aynı zamanda KSG dizisi yanında yerleşmiş bir Q552E değişimi saptandı. Ayrıca, Pens kontrol susu R6'dan %32.7 farklılık gösteren 406 nükleotidlik bir segment, S. mitis'in pbp2b sekansı ile %97 oranında benzer bulundu. BOX-PZT kullanılarak, yüksek düzey PenR, düşük düzey PenR ve Pens suşlar arasında sırasıyla; 8, 60 ve 17 farklı BOX-PZT paterni saptandı. Ankara'dan izole edilen altı izolat ve İzmir ve İstanbul'dan izole edilen birer izolat İspanya 23F klonu ile benzer olduğu belirlendi. Ayrıca üç Ankara ve birer İzmir ve istanbul izolatının BOX PZT paternlerinin ise İspanya 6B klonu ile benzer olduğu saptandı. PBP1a, PBP2b ve PBP2x için PBP-REA paternleri incelendiğinde, sırasıyla, 12, 8 ve 15 farklı PBP- REA paterni saptandı. Bunların kombinasyonları izolatlar arasında toplam 55 farklı PBP-REA paterni ortaya çıkardı. Penisilin dirençli suşlar arasında en sık görülen PBP-REA paterni (1/2/1 paterni) duyarlı izolatlar arasında saptanmadı. Benzer olarak, duyarlı suşlarda en sık görülen 2/4/5 patemin de sadece bu gruba özgül olduğu bulundu. BOX-PZT patemlerine göre, penisiline dirençli S. pneumoniae izolatlarının çoğu klonal olarak birbirinden farklılık gösterdi. BOX-PZT sonuçları ile karşılaştırıldığında, izolatların PBP-REA paternleri daha kısıtlı olarak bulundu. Bu sonuç, BOX-PZT için tüm kromozomun ve REA için spesifik pbp genlerinin araştırılması olarak tanımlanan tekniklerin genomdaki farklı özellikleri saptaması ile açıklandı. Sonuç olarak, yöntemler arasında farklılıklar bulunmasına rağmen, ülkemizde izole edilen penisilin dirençli pnömokoklar arasında belirgin bir klonal ilişki ve yayılım saptanmamıştır. Çalışmamız, ülkemizde izole edilen pnömokokların pbp sekanslarındaki mutasyonları inceleyen ilk çalışmadır ve diğer ülkelerde yapılmış çalışmalarda bildirildiği gibi S. pneumoniae izolatlarının penisilin direncinden pbp genlerindeki mutasyonların sorumlu olduğu belirlenmiştir. Anahtar Sözcükler: Streptococcus pneumoniae, penisilin direnci, epidemiyoloji, PBP1a, PBP2b, PBP2x, BOX-PZT, REA, nükleotid dizi analizi

SUMMARY Molecular Epidemiology of Penicillin Resistant Streptococcus pneumoniae Strains Meral Biçmen Streptococcus pneumoniae has been the primary cause of community- acquired pneumoniae all over the world. In our country, there has not been sufficient knowledge concerning the molecular epidemiology of penicillin resistant S. pneumonie strains. In the present study, the clonal relationship among a total of 1 10 S. pneumoniae strains which had been isolated at 7 different centers between November 1999 and January 2001 was investigated. Penicillin (Pen) and erythromycin (E) MICs were analyzed by E-test. Cefotaxime (CTX) MICs were determined by microdilution and E-test. Susceptibility patterns for other agents, namely clindamycin (CC), tetracycline (TE), chloramphenicol (C), trimetophrim sulfamethoxazole (TMP-SMX), ciprofloxacin (CIP) and levofloxacin (LEV) were studied by disk diffusion. Capsular serotypes were determined by coagglutination and quellung reactions. Clonal relationship among the isolates and similarities of the patterns with 16 penicillin-resistant clones defined by the Pneumococcal Molecular Epidemiology Network (PMEN) were investigated by BOX-PCR using BOX-A1R primer. Additionally, PBP1a, PBP2b and PBP2x patterns were determined by REA. Nucleotide sequence analysis of popla, pbp2b and pöp2x genes of 21 strains [eight high-level penicillin-resistant (PenR), nine low-level penicillin-resistant (Pen1) ve four penicillin-susceptible (Pens)] representing the whole group was performed. As a result, among the strains, 10(9.1%) were PenR, whereas 80(72.7%) were Pen1 and 20(18.2%) were found as Pens. Resistance rates for CTX, E, CC, TE, C and TMP-SMX were 0.9%, 29.1%, 29.1%, 27.3%, 18.2% and 76.4%, respectively. In general, Pen` strains were also resistant to the other antibiotics. Most of the PenR isolates were also resistant to other antibacterial agents but not to quinolones. Serotypes 23, 14, 19, 9V, 6B and 15B were the most frequent serogroups among PenR isolates. When compared to the sequence of R6, the nucleotide and peptide sequences of Penl/R isolates contained up to 14.9% and 8.5% divergence, respectively. Phylogenetic trees were constructed according to the pbp sequences and it was seen that most Turkish isolates clustered together with high bootstrap values at a separate branch, apart from the Gen-Bank sequences. The most common alterationin the PBP1a sequences of our isolates, was a T371A mutation in the active site STMK motif. A 574NTGY577 block instead of TSQF was also detected in all isolates. A T451A and a E481G mutation was found in the PBP2b sequences in 65% and 86% of the Penl/R isolates, respectively. All isolates also possessed a SVES/TK block between the 570 and 574th aminoacids, instead of the QLQPT sequence of R6. The analysis of the pbp2x genes revealed a T338A alteration in the STMK motif in 71 % of the isolates. Three isolates also had a Q552E change located near the KSG box. Moreover, a segment of 406 nucleotides which is 32.7 % divergent from the R6 homologue, showed 97% similarity to the pöp2b sequence of S. mitis. When BOX-PCR was used, 8, 60 and 1 7 unique molecular patterns patterns were identified among high-level PenR, low-level PenR and Pens strains respectively. Six isolates from Ankara and one from izmir and one from Istanbul showed similarity with Spanish 23F clone. Additionally, similar BOX-PCR patterns with Spanish 6B clone were determined in three isolates from Ankara, one from Izmir and one from Istanbul. Twelve, 8 and 15 different PBP-REA patterns were detected by the analysis of PBP1a, 2b and 2x, respectively. The combination of these revealed a total of 55 REA patterns among the isolates. The most common PBP-REA pattern (pattern 1/2/1) observed in penicillin-nonsusceptible strains, was not detected among the susceptible isolates. Likewise, the most common pattern of susceptible strains (pattern 2/4/5) was specific to only this group. According to BOX-PCR patterns, most of the penicillin non-susceptible S. pneumoniae isolated in Turkey, were diverse clonally. PBP-REA patterns of the isolates were more limited when compared to BOX-PCR results which can be explained by different specificities of the techniques, namely the whole chromosome for BOX-PCR and specific pbp genes for REA. Although discrepancies exist between different methods, a significant clonal relationship and spread was not detected among penicillin nonsusceptible pneumococci isolated in Turkey. This is the first study which analyzed the alterations in the pbp sequences of pneumococci isolated in Turkey. As reported previously, the emergence of penicilin resistant S.pneumonaie is a consequence of alterations in the three major PBPs. Key words: Streptococcus pneumoniae, penicillin resistance, epidemiology, PBP1a, PBP2b, PBP2x, BOX-PCR, REA, nucleotide sequence analysis.