Mycobacterium tuberculosis suşlarının moleküler tiplendirmesi

Abstract

1.0ZET Mycobacterium tuberculosis Suşlarının Moleküler Tiplendirmesi Dünyada çeşitli coğrafık bölgelerde, Mycobacterium tuberculosis suşlarının epidemiyolojisi ile ilgili araştırmalar yapılmasına karşın, ülkemizde bu konuda yeterli veri bulunmamaktadır. Son yıllarda, moleküler tiplendirme yöntemleri M. tuberculosis suşlarının epidemiyolojik çalışmalarında önemli yer tutmaktadır. Bu tez çalışmasında, İzmir'de iki merkezde soyutlanan 56 (31 duyarlı, 25 dirençli) M. tuberculosis izolatının üç farklı moleküler yöntem ile tiplendirilmesi amaçlandı. Çalışmaya alınan tüm M. tuberculosis izolatları üç yöntem ile tiplendirildi. İlk olarak, uluslararası, standardize edilmiş protokoller ile /S6110 RFLP yöntemi uygulandı. İkinci yöntem olan spoligotiplendirmede, ticari olarak sağlanan spoligotiplendirme kiti (Isogen Bioscience BV, Maarssen, Hollanda) ile üretici firmanın önerileri doğrultusunda gerçekleştirildi. Son olarak, farklı primerler kullanılarak iki ayrı RAPD PZT ile suşların tiplendirmesi yapıldı. /S6110 RFLP, spoligotiplendirme ve RAPD PZT'nin ayırım güçleri Hunter Gaston İndeksi (HGI) ile analiz edildi. /S6110 RFLP yöntemiyle yapılan tiplendirmede, 56 izolattan 10'u (%17.9) her küme içinde aynı patern gözlenen iki izolat olmak üzere beş ayrı kümede toplandı. Geri kalan 46 (%82.1) izolatta ise farklı özgül /S6110 RFLP paternleri gözlendi. Toplam 56 izolatta 51 RFLP paterni belirlendi. Ondört (%25) izolat, düşük kopya sayılı (£ 5) olarak bulundu. RFLP paternleri aynı olan izolatların /S6110 kopya sayısı her grupta 2, 4, 5, 7 ve 7 olarak bulundu. Spoligotiplendirme sonuçlarına göre toplam 35 spoligopatem belirlendi. Yirmibeş (%44.6) izolatta özgül spoligotiplendirme paternleri gözlenirken aynı patentlere sahip 31 (%55.4) izolat 10 küme içerisinde toplandı. Spoligopaternleri aynı saptanan 10 izolatın IS6110 RFLP paternleri de aynı bulunmasına karşın, diğer 21 izolatın /S6110 RFLP paternleri farklı idi. İstatistiksel olarak, RFLP ile özgül bulunan izolatların %54.3'ü spoligotiplendirme ile de özgül bulundu. 16S-23S RAPD ile tüm izolatlarda yaklaşık 600 ve 300-400bp büyüklüğünde iki belirgin bant ve bazı izolatlarda ise belirgin olmamakla birlikte 250-300 ve yaklaşık 400bp büyüklüklerindebantlar elde edileli. P-5 primeri ile uygulanan ikinci RAPD analizinde izolatların tümünde 200-250 ve 100-150 bp büyüklüğünde iki belirgin bant elde edilirken, bazı izolatlarda belirgin olmayan yaklaşık 400bp büyüklüğünde bantlar elde edildi. Belirgin bantlar değerlendirildiğinde RAPD analizinin kullanılan primerler ile ayırım gücünün olmadığı ve belirgin olmayan bantlar dışındaki bantların değerlendirilmesinin sübjektif sonuçlara neden olabileceği düşünüldü. RFLP, spoligotiplendirme ve RAPD için HGI indeksi sırasıyla 0.997, 0.964 ve 0 olarak bulundu. RFLP ve spoligotiplendirme yöntemlerinin birlikte değerlendirilmesiyle HGI, 0.997 olarak bulundu. Bu verilerle epidemiyolojik araştırmalarda /S6110 RFLP ve spoligotiplendirme yeterli yöntemler olarak kabul edilirken, RAPD PZT'nin yeterli bir yöntem olmadığı saptandı. Anahtar sözcükler: Mycobacterium tuberculosis, moleküler tiplendirme, epidemiyoloji, IS6110 RFLP, spoligotiplendirme, RAPD PZT

2. SUMMARY Molecular Characterization of Mycobacterium tuberculosis Strains Although the epidemiology of Mycobacterium tuberculosis strains have been investigated in various areas in the world, there has not been sufficient data about this issue in our country. In recent years, molecular typing methods have been used in the epidemiologic studies of M. tuberculosis isolates. In the present thesis, 56 (31 susceptible, 25 resistant) M. tuberculosis strains isolated from two centers in Izmir were characterized by three different molecular methods. All M. tuberculosis isolates which were taken into the study were characterized by three different methods. Initially, /S6110 RFLP was performed by an internationally standardized procedure. As a second method, spoligotyping was applied with a commercially available spoligotyping kit (Isogen Bioscience BV, Maarssen, The Netherlands) according to the manufacturer's recommendations. Finally, strain typing of the isolates was done by using RAPD PCR with two different primers. Discrimination ability of all three methods was analysed by Hunter Gaston Index (HGI). Same /S61 10 RFLP patterns within 10 of 56 isolates (17.9%) were found in five clusters including two isolates in each. Unique patterns were observed in the remaining 46 (82.1%) isolates. Among 56 isolates, 51 RFLP patterns were identified. Fourteen (25%) isolates were indicated as the isolates with low copy number (s 5). According to the spoligotyping results; totally 35 patterns were identified. Thus, a total of 31 (55.4%) isolates in 10 clusters were found. Unique spoligopatterns were observed in the remaining 25 (44.6%) isolates. Among these isolates, 10 of them had the same RFLP patterns, whereas the remaining isolates had different RFLP patterns. Statistically, 54.3% of the isolates which were found as unique according to the RFLP also were unique with spoligotyping. When we evaluated the clear and reproducible bands, in 16S-23S RAPD, we obtained two bands which were approximately 600 and 300-400 bp in size in all of the isolates. Besides these, some bands corresponding approximately 400 and 250-300 bp in sizewhich were not so clear were also seen. In another RAPD analysis by using P-5 primer, two significant bands which were 200-250 and 100-150 bp in size and another unclear band which was approximately 400 bp were obtained. According to these findings, when only clear and reproducible bands were considered, RAPD analysis by using these primers was not effective in molecular discrimination of the isolates and it was suggested that subjective results might be achieved by the evaluation of unclear bands. HGI was found as 0.997, 0.964 and 0 for /S6110 RFLP, spoligotyping and RAPD PCR, respectively. Evaluating the RFLP and spoligotyping together, HGI was 0.997 as well. Therefore, /S61 10 and spoligotyping were accepted as available methods for molecular epidemiologic studies in contrast with RAPD PCR. Key words: Mycobacterium tuberculosis, molecular typing, epidemiology, /S6110 RFLP, spoligotyping, RAPD PCR