Hepatoselüler karsinomada IP3 kinaz sinyal yolağının önemi

Abstract

Hepatosellüler karsinoma (HCC) dünyadaki en yaygın oalrak gözlenen beşinci kanser türüdür ve tam olarak tedavisi mümkün değildir. Fosfo İnositol 3-Kinaz sinyal (PI3K) yolağı, hücre sağ kalımını ve proliferasyonunu, dolayısıyla tümör gelişiminde rol oynayan sinyal yolaklarını yönlendirmektedir. HCC'de dahil olmak üzere çeşitli kanser tiplerinde, bu yolağın ara mesajcısı olan Akt proteininin aşırı aktif hale geldiği bilinmektedir. HCC hücre dizilerinde PI3K/Akt sinyal yolağı aktivasyon durumu ve bu yolağın baskılanmasının moleküler ve hücresel etki mekanizmaları tam olarak belirlenememiştir. Çalışmamızda HCC hücre hatlarında PI3K/Akt sinyal yolağın aktivasyon durumunu ve bu yolağın baskılanmasının hücre davranışlarına etkisinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bunun için dokuz HCC hücre dizisinde bazal koşullarda ve uyarılma sonrasında PI3K/Akt yolağının aktivasyon durumu ve yolağın PI3K'e özgül LY294002 inhibitörü ile baskılanması sonrasında ortaya çıkan hücresel davranış değişikliklerini incelenmiştir. Yolağın aktivasyon durumunu belirlemek için Western blotlama ve immünoboyama yöntemleri ile Akt ve aktive olmuş fosforile Akt protein düzeyleri incelenmiştir. Akt düzeyi ve/veya aktivasyonunun HCC hücrelerinde davranış değişikliklerine neden olup olmadığı değerlendirilmiş; bunun için, MTT ve BrdU inkooperasyon yöntemleri ile hücre proliferasyonu, LDH testi ile hücre ölümü, FACS analizi ile hücre döngüsü ve hücrelerin yara kapatma etkinlikleri ile hücre motilitesi belirlenmiştir. PI3K/Akt yolağının HCC hücre dizilerindeki aktivasyon düzeyinin farklı olduğu az diferansiye hücrelerde Akt aktivasyon düzeyinin diğer hücrelere göre daha yüksek seviyede olduğu saptanmıştır. Aynı zamanda bu hücrelerde PI3K/Akt yolağının çeşitli büyüme faktörleriyle uyarılabileceği belirlenmiştir. Bunlara ek olarak PI3K/Akt yolağının baskılanmasıyla hücre proliferasyonunun azaldığı, bu azalmanın hücre döngüsünde G1 safhasındaki birikmelerden kaynaklandığı gözlemlenmiştir. Akt yolağı aktivasyonu ile hücre motilitesinin arttığı bu yolağın inhibisyonunun hücrelerin hareketliliğini azalttığı gösterilmiştir. Verilerimize göre PI3K/Akt yolağı baskılanması hücrelerin proliferasyonu ve hareketliliğini dolayısıyla tümörojenik gelişimi ve ilerleyişini azaltmaktadır. Elde edilen sonuçlar PI3K/Akt yolağının önemli olduğunu ve HCC tedavisinde önemli bir hedef olabileceğini düşündürmektedir.

HCC is the fifth of the most prevalent cancer types and it is not exactly curable. Phospho İnositol 3- Kinase (PI3K) pathway controls signaling pathways that play role in tumor formation and thus cell survival and proliferation. Including HCC, it is known that Akt (PKB) protein which is the mediator of this pathway becomes overactive in many cancer types. Molecular and cellular mechanisms of PI3K/Akt signaling pathway activation and inhibition in HCC cell lines have not been well established. The aim of the study is determinate the activity of PI3K/Akt signaling pathway and the molecular and cellular effect of inhibition this pathway. PI3K/Akt pathway activation and behavioral changes of the cells after inhibition of this pathway with LY294002 inhibitor; which is specific to PI3K; at basal and stimulated conditions in nine HCC cell lines were observed. Phoshorylated Akt in the protein level to identify activation of the pathway by using Western blotting and immunostaining methods were examined. For examine the changes of cells behavior; to determine cell proliferation MTT and BrdU incorporation assays, for cell mortality LDH test, for cell cycle analysis FACS analysis and for motility of the cells wound assay were used. That activation level of PI3K/Akt pathway is different levels in HCC cell lines and the activation of pathway is higher at poorly differentiated HCC cells than differentiated ones was determined. Beside it was observed that the PI3K/Akt pathway can stimulate with several growth factors. Cell proliferation decreases by inhibition of PI3K/Akt pathway; this decrease is a result of the G1 arrest in cell cycle and cell motility decrease were shown. The motility of cells increased with stimulation of this pathway and decreased with inhibition this pathway was observed. As a result, we found that, inhibition of PI3K/Akt pathway decreases cell proliferation and motility thus tumorogenic potential of cells. Our results indicate that, PI3K/Akt pathway is important in HCC and Akt pathway could be an important target in HCC treatment.