Kedi granüloza hücre kültüründe, FSH ve LH hormonlarının steroidojenik aktivite üzerine etkilerinin araştırılması

Abstract

Bu çalışmada, kedi granüloza hücre kültüründe, 22(R)-hidroksikolesterol (22R-HC), folikül uyarıcı hormon (FSH) ve lüteinleştirici hormon (LH)`un progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkileri araştırıldı.Çalışmada toplam 18 adet dişi kedi kullanıldı. Kediler altışarlı 3 gruba ayrıldı. Birinci gruptaki kedilerden elde edilen granuloza hücreleri, bazal progesteron ve östradiol düzeylerinin belirlenmesi ile kolesterolün (10 ng/ml) progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkisinin incelenmesinde kullanıldı. İkinci gruptaki kediler, FSH (10 ve 100 ng/ml) ile FSH ve kolesterolün (10 ng/ml) kombine kullanımının; üçüncü gruptaki kediler ise, LH (10 ve 100 ng/ml) ile LH ve kolesterolün kombine uygulanmasının bazal progesteron ve östradiol sentezi üzerine etkisinin incelenmesinde kullanıldı.PMSG hormon uygulamasını takiben 5. günde kedilerden ovariohisterektomi operasyonu ile ovaryumlar alınarak steril şartlar altında laboratuara getirildi. Laminar flow içerisinde foliküller ikiye ayrılıp, granüloza hücreleri folikül duvarından toplandıktan sonra % 5 fetal calf serum (FCS) ile kaplanmış 24 kuyucuklu pleytte 5 gün süre ile inkübe edildi. Kültür mediumu olarak, 10-7M androstenedione, % 0.1 ITS ve % 0.1 bovine serum albumin içeren Dulbecco's Modified Eagle's mediumu (DMEM) / HAM F-12 kullanıldı. Kültürün 1. ve 3. günlerinde hücrelere 22R-HC (10 ng/ml), FSH (10 ve 100 ng/ml), LH (10 ve 100 ng/ml), FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + LH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml) uygulamaları yapıldı. Üçüncü ve beşinci günlerde ise uygulamaların yapıldığı kuyucuklardaki mediumlar toplanarak, hücrelerin sentezledikleri progesteron ve östradiol düzeyleri ölçüldü.Kolesterolün uygulandığı gruplarda, progesteron sentezinde kültürün 3. ve 5. günlerinde, östradiol sentezinde ise sadece kültürün 5. gününde önemli bir artış gözlendi (p<0.001). Kolesterol uygulanan gruplarda bazal progesteron miktarında kültürün 3. gününde 9.1 kat ve 5. gününde ise 13.5 kat artış belirlendi. Bazal östradiol miktarında ise kültürün 3. gününde önemli bir artış bulunmamasına rağmen, 5. gününde 4.7 kat artış tespit edildi. Folikül uyarıcı hormonun her iki dozunda da progesteron sentezinde önemli bir fark bulunmamasına rağmen östradiol miktarındaki fark önemli bulundu (p<0.001). Lüteinleştirici hormon uygulanan gruplarda bazal progesteron ve östradiol miktarında kültür süresince istatiksel olarak önemli bir fark bulunmadı (p>0.05). Östradiol miktarında ise sadece LH`ın yüksek doz (100 ng/ml) uygulandığı gruplarda kültürün 5. gününde, meydana gelen artış önemli bulundu (p<0.05). Kültürde FSH ve LH`ın 22R-HC ile kombine kullanımının hem östradiol hem de progesteron miktarını önemli miktarda arttırdığı tespit edildi (p<0.001). Kültür sonunda, granüloza hücreleri 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß?HSD) aktivitesi yönünden boyandı. Boyama sonucunda yüksek doz (100 ng/ml) FSH`ın 22R-HC (10 ng/ml) ile kombine uygulandığı grupta 3ß?HSD enzim aktivitesinin daha yüksek olduğu gözlendi.Sonuç olarak mevcut çalışma ile kedilere özel bir granüloza hücre kültürü protokolü geliştirildi. Bu protokolün, kedi granüloza hücre stereoidogenezisi üzerine daha detaylı çalışmaların yapılmasına ve folikül içerisindeki etkin mekanizmaların ortaya konulmasına olanak sağlayabileceği düşünülmektedir.

The objectives of this study were to examine the effects of 22R-hydroxycholesterol (22R-HC), Follicle stimulating hormone (FSH) and Luteinizing hormone (LH) on oestradiol and progesterone production by cat granulosa cells.In this project, 18 female cats were used. The cats were assigned into three groups each having six animals. The first group was used to determine basal level of the progesterone and oestradiol, and in addition to the investigation of cholesterol (10 ng/ml) effects on basal level of the steroid synthesis. The second group was used to determine effect of FSH (10 ve 100 ng/ml) and FSH plus cholesterol (10 ng/ml) on basal level of the steroid synthesis. The remaining group was used for investigation effect of LH (10 ve 100 ng/ml) and LH plus cholesterol (10 ng/ml) on basal level of the progesterone and oestradiol in granulosa cells.The ovaries are transfered to the laboratory under sterile conditions after collected by laparotomy operation on day 5 following PMSG injection. The follicles were bisected in the laminar flow. Granulosa cells from follicles were collected and cultured for up to 5 days in 24 well plates coated with 5% fetal calf serum (FCS) in Dulbecco?s Modified Eagle?s Medium (DMEM) / HAM F-12 : supplemented with 10-7M androstenedione, 0.1 % ITS and 0.1 % bovine serum albumin. The cells were treated with 22R-HC (10 ng/ml), FSH (10 ve 100 ng/ml), LH (10 ve 100 ng/ml), FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + LH (10 ve 100 ng/ml), 22R-HC (10 ng/ml) + FSH (10 ng/ml) + LH (10 ng/ml) on first and third day. After incubation, used medium was collected on day 3 and 5, and then measured the level of progesterone and oestradiol synthesis.Treatment of cells with 22R-HC resulted in an increase (p<0.001) in progesterone on day 3 and 5 of the culture, and in oestradiol production on day 5. When 22R-HC was used at a concentration of 10 µg/ml, it resulted in 9.1 and 13.5 fold increase in bazal progesterone production on day 3 and 5, and 4.7 fold increase in bazal oestradiol production was determined on day 5, respectively. Incubation of cells with both concentrations of FSH (10 ng/ml and 100 ng/ml) resulted in significant stimulations of progesterone (p<0.001) on day 3 and 5 while had no effect on oestradiol production. None of the doses of LH had any effect on oestradiol production on day 3, nor progesterone production on day 3 and 5 by granulosa cells from the follicles. However, on day 5, higher dose of LH (100 ng/ml) resulted in significant stimulation on oestradiol production (p<0.05). With the inclusion of 22R-HC in to the culture system, in the presence of all doses of FSH and LH, progesterone and oestradiol productions were enhanced (p<0.001). At the end of the culture, granulosa cells were stained for 3ß-hydroxysteroid dehydrogenase (3ß-HSD) activity. The cells which were treated with combination of 22R-HC and higher dose of FSH (100 ng/ml) stained darker for 3ß?HSD enzyme activity.The results of this study demonstrated the development of a culture system for cat granulosa cells. This system will permit the detailed study of the key factors controlling the folliculogenesis and the steroidogenesis of cat granulosa cells.