Molecular cloning and recombinant production of human (EpCAM) extracellular domain

Abstract

Epitelyal hücre adezyon molekülü (EpCAM, CD326), epitel hücrelerde Ca+2 'a bağımlı homotipik hücre-hücre adezyonuna aracılık eden ve yaklaşık 40 kDa boyutunda, tip I transmembran glikoproteinidir. EpCAM iki alt domainden oluşmaktadır; bir hücre dışı domain (EpEX) ve bir hücre içi domain (EpICD), bu iki domain bir transmembran sarmal ile ayrılmıştır. Sağlıklı dokularda, EpCAM hücreler arası sinyal iletimi ve hücre göçü gibi bir çok temel biyolojik proseste görev almaktadır. EpCAM'in epiteliyal tümör dokularında yüksek seviyede ekspresyonu ve sağlıklı epitel hücrelerinde düşükseviyede eksprese olması kanser tanısında bir biyolojik belirteç olarak kullanılmaktadır. Daha önce yapılan çalışmalar EpCAM'in iyi bir anti-tümör hedefi olarak görev yapabileceğini göstermiştir. Bu teknikler başlıca, immünoterapötik stratejiler, aşılama, RNA aptamerleri. Bu çalışmada, sonraki uygulamalarda kullanılması amacıyla (E. coli) tabanlı bir ekspresyon sisteminde rekombinant EpEX moleküllerini ifade etmeyi ve saflaştırmayı amaçlanmıştır. Bu amaçla, EpEX'i yüksek seviyede ifade eden iki farklı insan kanser hattından toplam fragmentleri, bakteriyel ekspresyon ve rekombinant proteinlerin saflaştırılması için bir plazmit vektörü olan pGEX-6P1'e entegre edildi. Doğru pGEX-6P1-EpEX klonunlarını içeren kolonilerin tespiti için öncelikle PCR taraması ve sonrasında restriksiyon enzimleri ile kesilen plasmidlere Sanger dizi analizi yapılarak doğru klonlar seçildi. Seçilen klonlar recombinant protein üretimi amacıyla E. coli BL21 strainine transfekte edildi. Rekombinant EpEX molekülü için en yüksek verimi ve saflığı elde etmek için, indüksiyon, ekspresyon ve saflaştırma koşulları optimize edildi. Üretilen GST-EpEX, glutatyon-agaroz taneleri kullanılarak afinite kromatografısiyle saflaştırıldı. Saflaştırılan rekombinant EpEX moleküllerini boncuklara bağlı kalan GST etiketinden ayırmak için HRV3C proteaz enzimi kullanıldı. Son olarak, izole edilen protein SDS-PAGE yapılarak doğrulandı.

Epithelial cell adhesion molecule (EpCAM) is a type I transmembrane glycoprotein of approximately 40 kDa size that facilitates Ca2+-independent homotypic cell and cell adhesion in epithelia. EpCAM consist of two domains; extracellular domain (EpEX) and intracellular domain (EpICD), separated by a transmembrane helix. EpCAM's roles include cellular signaling and migration. The overexpression of EpCAM in epithelial tumors and downregulation in normal epithelia is used as a diagnostic tumor marker. Previous studies demonstrated that EpCAM can serve as an attractive anti-tumor target such as immunotherapy, RNA aptamers, and vaccination. Therefore, we aimed to express and purify recombinant EpEX molecules in an (E. coli) based expression system in order to use it in downstream applications. RNA isolated from two different human cancer lines highly expressing EpCAM was used to amplify the cDNA coding for EpEX. PCR amplified EpEX cDNA fragments were ligated into pGEX-6P1, a plasmid vector for bacterial expression and purification of recombinant proteins. The correct pGEX-6P1-EpEX clone was isolated and verified by colony PCR screening, restriction analysis, and subsequent Sanger sequencing. The plasmid was transferred to BL21 strain for expression of the recombinant protein. In order to obtain the highest yield and purity for recombinant EpEX molecule, induction, expression and purification conditions were optimized. GST-EpEX was purified by affinity chromatography utilizing glutathione-agarose beads. HRV3C protease was used to cleave and release the recombinant EpEX molecules from the GST tag that remains bound to the beads. And finally, the results were analyzed by Coomassie Blue staining of SDS-PAGE separated protein samples.